В отличие от традиционной техники получения антител, гибридомная техника впервые позволила получить моноклональные антитела (антитела, продуцируемые потомками одной единственной клетки). Моноклональные антитела высокоспецифичны, они направлены против одной антигенной детерминанты.
Основные этапы гибридомной техники следующие. Мышей иммунизируют антигеном, после этого из селезенки выделяют спленоциты, которые в присутствии полиэтиленгликоля сливают с дефектными опухолевыми клетками (обычно дефектными по ферментам запасного пути биосинтеза нуклеотидов - гипоксантина или тиамина). Далее на селективной среде, позволяющей размножаться только гибридным клеткам, проводят их отбор. Питательную среду с растущими гибридомами тестируют на присутствие антител. Положительные культуры отбирают и клонируют. Клоны инъецируют животным с целью образования опухоли, продуцирующей антитела, либо наращивают их в культуре. Асцитная жидкость мыши может содержать до 10-30 мг/мл моноклональных антител.
Гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, и в любое время вводить дозу такого клона в животное той линии, от которой получены клетки для слияния. В настоящее время созданы банки моноклональных антител. Антитела применяют в разнообразных диагностических и терапевтических целях, включая противораковое лечение. Таким образом, клеточная инженерия является эффективным способом модификации биологических объектов и позволяет получать новые ценные продуценты на органном и также клеточном и тканевом уровнях.
3. Получение продуцентов для биотехнологических процессов
При создании промышленных штаммов-продуцентов, пригодных к использованию в биотехнологических процессах, возможны разные подходы. Классический подход заключается в выделении нужного микроорганизма из природной среды. Из естественных мест обитания предполагаемого продуцента отбирают образцы материала и производят посев в элективную среду, обеспечивающую преимущественное развитие интересующего микроорганизма, т. е. получают так называемые накопительные культуры. Следующим этапом является выделение чистой культуры, то есть содержащей микроорганизмы одного вида, с дальнейшим дифференциально-диагностическим изучением изолированного микроорганизма и определением его способности продуцировать нужный продукт. Существует и другой путь подбора микроорганизмов-продуцентов. Это выбор нужного вида из имеющихся коллекций хорошо изученных и досконально охарактеризованных микроорганизмов. Главным критерием при выборе биотехнологического объекта является способность синтезировать целевой продукт и, главное, - уровень продукции. Однако помимо этого, в технологии самого процесса могут закладываться дополнительные требования, которые являются очень важными. Микроорганизмы должны: обладать высокой скоростью роста; утилизировать необходимые для их жизнедеятельности доступные субстраты; быть резистентными к посторонней микрофлоре. Все вышеперечисленное обеспечивает значительное снижение затрат на производство целевого продукта. Однако такие продуценты («дикие» штаммы), как правило, не обладают способностью к сверхпродукции, которая делает производство прибыльным.
Для того чтобы извлечь из потенциала микроорганизмов все наиболее ценное, используют методы воздействия на геном, существенно расширяющие их производственные возможности - селекцию и мутагенез, а также генетическую инженерию.
3.1 Получение продуцентов методами селекции
Традиционно для получения более активных биологических агентов - продуцентов - применяли селекцию и мутагенез. Селекция - это направленный отбор мутантов - организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции - это путь от слепого отбора нужных продуцентов к сознательному конструированию их генома. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и др. микроорганизмов.
Для изменения природных способностей микроорганизмов используют изменения генотипа - мутации, приводящие к усилению природных способностей микроорганизмов синтезировать и продуцировать нужные вещества, а также синтезировать вещество в избытке - сверх своих потребностей и продуцировать его. Мутации, способствующие сверхсинтезу продукта, могут затрагивать большое число структурных генов, кодирующих ферменты всех этапов синтеза, транспорта и катаболизма данного продукта, а также регуляторные гены. Результат таких мутаций может проявиться в следующих основных изменениях метаболизма клеток:
1) повышение скорости поглощения и утилизации субстрата;
2) повышение уровня синтеза и активности ферментов, участвующих в синтезе продукта;
3) блокирование синтеза побочных продуктов;
4) блокирование дальнейшего превращения продукта;
5) обеспечение экскреции (выделения) продукта из клетки.
Чаще требуется сочетание нескольких мутаций для сверхсинтеза продукта.
Мутации могут быть неконтролируемыми (спонтанными) и контролируемыми (индуцируемыми). Ограничения метода селекции связано с низкой частотой спонтанных мутаций, приводящих к изменению в геноме. Ген должен удвоиться в среднем 106-108, чтобы возникала мутация. К существенному ускорению процесса селекции ведет индуцированный мутагенез (увеличение частоты мутаций биологического объекта при искусственном повреждении генома в десятки и тысячи раз). Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, ультразвук, ряд химических соединений. К последним относятся окислители, способствующие окислительному дезаминированию азотистых оснований (азотистая кислота, гидроксиламин, перекись водорода), азотистые основания, ингибирующие синтез нуклеиновых кислот и приводящие к ошибкам включения (2-аминопурин, 5-бромурацил, 5-аминоурацил), алкилирующие агенты (металлоорганические соединения, формальдегид, этиленимин, диметилсульфат, нитрозогуанидин, нитрозоэтилмочевина). Применяют и биологические мутагены - вирусы, биотоксины.
Основные этапы селекции
1. Выбор исходного штамма для селекции
Выбирают природные продуценты нужных веществ или микроорганизмы, не продуцирующие нужные вещества, но обладающие другими ценными свойствами.
2. Подготовка исходного штамма к селекционной работе: ассе исходного штамма на чашки Петри, отбор колоний типичной формы с высокой продукцией целевого вещества.
3. Получение и отбор мутантов.
Мутагенами обрабатывают водные суспензии клеток в буферных растворах при оптимальном значении рН и заданном времени экспозиции. Дозу химического мутагена выбирают, ориентируясь на выживаемость микроорганизмов - отношение количества колоний, выживших после обработки мутагеном к контрольному количеству колоний, в %. Используют дозы, обеспечивающие выживаемость от 0,1 до 5-80%.
4. Отбор мутантов
а) Отбор случайных (непредсказуемых) мутаций по количественному признаку.
После обработки популяции мутагеном проводят тотальный скрининг (проверку) полученных клонов и отбирают наиболее продуктивные. Проводят повторную обработку отобранных клонов, и вновь отбирают продуктивные клоны, то есть проводят ступенчатый отбор по интересующему признаку. Работа эта требует больших трудозатрат и времени.
При открытии антибиотиков более 60 лет назад этот метод был единственно возможным. Классический пример такой селекции - получение современного продуцента пенициллина Penicillium chrysogenum с применением физических и химических мутагенов. Штамм, выделенный А. Флемигом в 1928 г., продуцировал лишь 50 единиц пенициллина в 1 мл культуральной жидкости (КЖ). Воздействие УФ-излучения и алкилирующих агентов позволило в 1960 г. передать в производство штамм, продуцирующий 5000 единиц и более в 1 мл КЖ. Сейчас используют штаммы с продукцией более десятков тысяч единиц/мл.
б) Отбор по количественному признаку среди мутантов с определенным фенотипом.
Фенотип (от греческого слова phaino - являю, обнаруживаю) - совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития. Фенотип складывается в результате взаимодействия наследственных свойств организма (набора генов) - генотипа - и условий среды обитания. Этот метод используется, если известны пути синтеза и регуляции нужного вещества. Наиболее часто рассматривают следующие фенотипические варианты - морфологические изменения, резистентность к структурным аналогам метаболитов, резистентность к антибиотикам, наличие ауксотрофии (ауксотрофия - потеря организмом способности синтезировать те или иные вещества вследствие повреждения генов и появление у такого организма дополнительных питательных потребностей). У мутантов с определенным фенотипом вероятность появления сверхпродуцентов резко возрастает, что уменьшает трудоемкость селекционной работы.
3.2 Получение продуцентов методами генетической инженерии
Ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры при получении новых пород животных, сортов растений или продуцентов практически ценных микроорганизмов:
1) нельзя скрещивать неродственные виды;
2) нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме;
3) нельзя предугадать, какое получится потомство.
Молекулярная биология вооружила ученых пониманием законов передачи от родителей потомству наследственной информации. Стали понятными причины ограничений классической селекции, а также то обстоятельство, что природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности своего генома, преодолеть практически невозможно.
Альтернативой классической селекции в получении организмов с заданными свойствами является генетическая инженерия, предмет которой - рекомбинация хромосом или отдельных генов вне организма, в пробирке (in vitro). Таким образом, преодолеваются все ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры. Первые удачные эксперименты такого рода сделаны в 1972 году, и вскоре был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro.
Возможности генетической инженерии:
1. Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции.
2. Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.
3. Можно предсказать результат, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).
Прежде, чем перейти к изучению основных методов генетической инженерии, целесообразно рассмотреть общие принципы процесса и специальную терминологию.
3.2.1 Теоретические предпосылки генетической инженерии
3.2.1.1 Термины и определения
Ген - структурная единица наследственности - участок ДНК, кодирующий структуру определенного белка или РНК.
Репликон - единица генома , способная к автономной репликации ДНК; содержит точку инициации репликации.
Экспрессия генов -- это процесс, в котором наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт -- РНК или белок.
Транскриптон - участок ДНК, подвергающийся транскрипции.
Кодон - триплет нуклеотидов, кодирующий отдельную аминокислоту.
Генетический код - соответствие кодонов определенным аминокислотам.
Оперон - комплекс функционально связанных структурных генов и оператора.
Генная инженерия или техника рекомбинантных ДНК - конструирование in vitro (в пробирке) функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК) путем переноса генетического материала из одного организма в другой.
Плазмида - кольцевая двухцепочечная внехромосомная ДНК, способная к автономной репликации.
Вектор - самореплицирующаяся (автономная) молекула ДНК, например, бактериальная плазмида, используемая в генной инженерии для переноса генов, часто в некотором числе копий) от организма-донора в организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей (клонирующий вектор).
Клон - популяция клеток, идентичных родительской клетке.
Клонирование в биологии - это получение точных копий организма или другого объекта, например, клетки или гена.
3.2.1.2 Важнейшие достижения молекулярной биологии
Молекулярная биология вооружила ученых пониманием законов передачи от родителей потомству наследственной информации. Стали понятными причины ограничений классической селекции, а также то обстоятельство, что природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности своего генома, преодолеть практически невозможно. А что если попытаться проводить рекомбинацию хромосом или отдельных генов вне организма (in vitro), в пробирке? Первые удачные эксперименты такого рода проведены в 1972 году, и вскоре был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro, затем вводить полученную генную конструкцию в клетку, при этом в последней синтезируются продукты введенных генов.
Фундаментальной базой генной инженерии явились открытые ранее механизмы экспрессии генов, внехромосомные молекулы ДНК - плазмиды, ферменты, позволяющие проводить рекомбинацию генов.
1. Молекулярные механизмы матричного синтеза.
Подробно механизмы матричного синтеза (репликации, транскрипции и трансляции рассматриваются в курсе «Основы биохимии»). Здесь мы коротко приведем основные положения.
Процесс удвоения молекулы ДНК называется репликацией ДНК (ДНК ДНК). Репликация осуществляется полуконсервативным путем на каждой из двух родительских цепей. Фермент - ДНК-зависимая ДНК-полимераза - синтезирует нить ДНК, комплементарную родительской цепи (называемой матрицей), последовательно присоединяя к 3'-концу растущей цепи дезоксирибонуклеотиды, комплементарные дезоксирибонуклеотидам матрицы. В процессе репликации родительская двухцепочечная ДНК расплетается, образуя репликативную вилку. Для того, чтобы ДНК-полимераза могла начать синтез, необходимо существование готового фрагмента ДНК или РНК, комплементарного матрице и содержащего свободную 3'-ОН-группу. Этот фрагмент называют затравкой (праймером).