Процесс биосинтеза РНК в клетке называется транскрипцией ДНК (ДНК РНК). Транскрипция осуществляется ферментами ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, которые используют ДНК в качестве матрицы. Цепь РНК растет в направлении 5'3'. В отличие от ДНК-полимераз, РНК-полимеразы способны к самостоятельной инициации синтеза РНК. Место инициации определяется специальными регуляторными участками ДНК - промоторами. Терминация синтеза также происходит на специальных участках ДНК - терминаторах. В клетках бактерий РНК синтезируется сразу в зрелом виде - в виде мРНК (матричная РНК), а у эукариотов - в виде предшественника мРНК, который должен подвергнуться процессингу - ферментативным превращениям, в результате которых образуется зрелая мРНК. Процессинг включает кэпирование (присоединение к 5'-концевому метилированному звену предшественника мРНК 7-метилгуанозина), полиаденилирование (присоединение к 3'-концу сегмента поли(А)), сплайсинг РНК (вырезание интронов и соединение экзонов - кодирующих последовательностей - в непрерывную последовательность).
Трансляция (мРНК белок) - многоступенчатый процесс синтеза белка согласно информации, заключенной в последовательности нуклеотидов мРНК. Трансляция осуществляется на клеточных органоидах - рибосомах, которые представляют собой нуклеопротеиды, в составе которых рибосомальная РНК (рРНК) и белок. При инициации происходит специфическое связывание рибосомы с мРНК и с первой аминоацил-тРНК, в результате чего образуется комплекс, способный к синтезу белка. При элонгации осуществляется последовательное связывание аминоацил-тРНК с образованием пептидных связей по программе, задаваемой последовательностью кодонов в мРНК. Терминация представляет собой отщепление готового белка от трансляционного комплекса. В ходе трансляции нуклеотидная последовательность мРНК считывается в направлении от 5'- к 3'-концу. Считывание происходит по законам генетического кода, согласно которым каждой аминокислоте соответствует триплет нуклеотидов (кодон), каждый кодон кодирует только одну аминокислоту, а последовательность кодонов мРНК определяет аминокислотную последовательность синтезируемого белка. Функцию узнавания кодона осуществляет не сама аминокислота, а молекула транспортной РНК (тРНК), к которой она присоединена и которая содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную кодону - антикодон.
2. Ферменты, позволяющие получать рекомбинантные молекулы ДНК.
Высокоспецифичные ферменты, способные узнавать и расщеплять ДНК в строго определенном месте, называются рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами.
Рестриктазы распознают в молекулах ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4 - 6 пар нуклеотидов (сайты узнавания) и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются фрагменты с ровными (тупыми) концами (рис.16), а во втором - стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят одна за другую. Такие одноцепочечные концы называются «липкими», поскольку они могут как бы слипаться между собой в силу комплементарности. Примером рестриктазы второго типа является EcoRI, которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ, и режет эту последовательность ДНК ассиметрично между нуклеотидами Г и А (рис.17). В результате место разреза в одной цепи смещено по отношению к другой на 4 пары оснований. При таком разрезе образуется два выступающих конца. Эти концы соединяются водородными связями. Если с той же EcoR1 получить фрагменты ДНК из различных организмов, то все они будут иметь одинаковые, подходящие друг к другу «липкие концы» (рис.17).
Рис. 16. а) схема действия фермента рестриктазы SmaI на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с тупыми концами после разрезания ферментом SmaI.
Рис. 17. а) схема действия фермента рестриктазы EcoRI на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с липкими концами после разрезания ферментом EcoRI.
Скрепить выступающие липкие концы двух молекул ДНК помогает другой фермент - ДНК-лигаза. Он лигирует, то есть «сшивает» между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК. Внешне она ничем не отличается от обычной ДНК. Сейчас в арсенале генных инженеров имеется более 500 различных рестриктаз, способных разрезать ДНК примерно в 120 различных местах.
Номенклатура рестриктаз базируется на названии микроорганизма, из которого она была впервые выделена. Первая прописная буква в обозначении рестриктазы соответствует первой букве названия рода, а последующие две или три строчные буквы берутся из первых букв названия вида этого микроорганизма. Далее может приводиться название штамма и, наконец, римская цифра обозначает порядковый номер фермента, отражающий хронологию его выделения из данного организма. Несколько рестриктаз и их сайты узнавания представлены в таблице 6.
Таблица 6. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности.
Для устранения разрыва после рекомбинации фрагментов ДНК используют другой фермент - ДНК-лигазу, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе водородными связями при соединении липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.
3. Векторы для экспрессии и клонирования.
В качестве векторов, способных переносить в клетку-реципиент генетическую информацию, чаще используют плазмиды и бактериофаги.
Плазмидные векторы.
Внехромосомные двуспиральные малые молекулы ДНК, длиной в 1-200 тысяч пар нуклеотидов автономно размножающиеся в клетке, называются плазмидами. Плазмиды, как правило, присутствуют у бактерий и являются кольцевыми молекулами, хотя у некоторых растений и грибов известны линейные плазмиды. Плазмиды выполняют разнообразные функции. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (криптические плазмиды; от англ, cryptic - скрытый, латентный). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала репликации ORI, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна.
На Рис. представлена генетическая карта плазмиды рВR322. Это одна из наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования. pBR322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из E. coli. Эта плазмида несет гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину (ген bla) и тетрациклину (ген tet), а также уникальные сайты для BamHI, Hind III и SalI в генеТеtг, один PstI-сайт в гене Атрг, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в Е.coli. Плазмидный вектор pBR322 в 80-е годы был одним из самых популярных универсальных векторов. Обычно обозначение плазмидного вектора включает строчную букву «р» (от англ, plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или к истории его создания. Так, буквы BR в обозначении плазмиды pBR322 указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса, сконструировавших эту плазмиду, а число 322 -- цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. Длина плазмиды pBR322 -- 41 т.п.н.
Рис.18. Генетическая карта плазмиды pBR322.
Если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику. Но при этом сохраняется устойчивость к другому антибиотику. Таким образом, вектор дает возможность детектировать только те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду.
Таким образом, требования, предъявляемые к векторам, включают: 1. Способность реплицироваться в клетке-хозяина; 2. Способность включать чужеродные ДНК различной молекулярной массы без нарушения способности к репликации; 3. Легкость введения в клетку-хозяина; 4. Наличие генетического маркера селекции, обеспечивающего быструю селекцию клеток, содержащих вектор; 5. Наличие только 1 сайта рестрикции для каждой рестриктазы.
Бактериофаг в качестве вектора.
С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т.п.н. Для клонирования более крупных фрагментов были разработаны векторы на основе бактериофага . Этот фаг является умеренным фагом E.coli К-12, содержащим двухцепочечную ДНК размером 48500 п.н. с одноцепочечными 5'-»хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами.
Примерно у 30% фаговых частиц ДНК интегрируется с бактериальной хромосомой и реплицируется вместе с ней (состояние лизогении, см. раздел 3.2).
Рис.19. Строение бактериофага
За способность к лизогении отвечает фрагмент около 20 т.п.н. Если этот фрагмент заменить фрагментом другой ДНК (кодирующей целевой белок), образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного» фага , вставшего на литический путь развития.
В частицы фага можно упаковать 37-52 т.п.н. Учитывая размер «плеч» 15 т.п.н., размер вставки около 15 т.п.н. (Рис.19). Схема клонирования ДНК с использованием фага представлена на Рис.20.
Рис.20. Схема клонирования ДНК с использованием фага в качестве вектора.
Векторы космидные и фазмидные
Фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15-25 т.п.о. Этого недостаточно для клонирования генов животных и растений, длина которых превышает 35-40 т.п.о. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами.
Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos-сайты ДНК фага лямбда. Отсюда происходит название всего типа данных векторов (cosmid) Рис. 21.
Рис.21. Космидный вектор для клонирования ДНК.
Наличие cos-сайтов в ДНК является единственным необходимым условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. Это означает, что последовательность нуклеотидов лямбда-ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, которая заключает в себе весь фаговый геном (35-45 т.п.о.), может быть замещена in vitro на аналогичный по длине фрагмент чужеродной ДНК и упакована в фаговые частицы. Такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной. Однако после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30-40 т.п.о. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селектируемые маркеры в виде генов устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания бактерий на среде с соответствующими антибиотиками. Несмотря на то, что емкость космидных векторов значительно выше фаговых, эффективность клонирования в космидах ниже, хотя и достигает в ряде случаев 105-106 колоний на 1 мкг клонируемой ДНК. При такой эффективности упаковки требуется всего лишь 2-4 мкг клонируемой ДНК для получения полной клонотеки большинства эукариотических геномов.
Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции. В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для лямбда-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий.
3.2.2 Технология рекомбинантных ДНК (рДНК)
Этапы генетического конструирования in vitro (Рис.22 ):
1. Получение нужного гена;
2. Встраивание полученного гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор), например, получение рекомбинантной плазмиды;
3. Введение гена в составе вектора (например, рекомбинантной плазмиды) в организм-реципиент, например в клетки E.coli;
4. Клонирование в E.coli фрагмента ДНК;
5. Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены.
6. Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки, изменяя их генотип и фенотип.
3.2.2.1 Получение генов, кодирующих целевые белки
Получение генов для экспрессии в клетках прокариот и эукариот возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментативным синтезом или ферментативным синтезом на основе выделенной матричной РНК (мРНК).
Выделение нужных генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать рестриктазы для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.
Для соединения фрагментов ДНК используют также линкеры и адапторы. Линкер - это синтетический короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания ряда рестриктаз. Он может быть присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью рестриктазы. Например, линкер EcoR1 представляет собой d 5'(ГГААТТЦЦ)3'. Адаптор - это линкер, содержащий больше, чем один сайт узнавания рестриктазой, то есть адаптор предназначен для соединения фрагментов с несовместимыми концами.