Учебное пособие: Основы биотехнологии

В цитоплазме эукариот содержится цитоскелет - система длинных полых структур, придающий клеткам форму, служит местом прикрепления органелл.

Сравнение про- и эукариотов представлено в Табл.3.

Таблица 3. Сравнение прокариотов и эукариотов

2.4.1 Грибы

Грибым (лат. Fungi или Mycota) -- особая форма жизни, царство живой природы, объединяющее эукариотические организмы, сочетающие в себе некоторые признаки как растений, так и животных. Они играют важную роль в биосфере, разлагая всевозможные органические материалы. Грибы - важнейшие продуценты в биотехнологии.

Изучение грибов - это предмет науки микологии. Грибы относятся к эукариотам, они растут в аэробных условиях и получают энергию путем окисления органических веществ, как и животные. Также они имеют клеточную оболочку, состоящую из хитина. С растениями их сближает ряд общих признаков: наличие клеточной стенки и вакуолей, заполненных клеточным соком, апикальный рост, хорошо видимое под микроскопом движение протоплазмы, неспособность к активному перемещению. В отличие от растений грибы не способны к фотосинтезу и слабо дифференцированы морфологически, у них почти нет разделения функций между разными частями организма.

2.4.1.1 Строение и классификация грибов

К грибам относятся истинные слизевики (миксомицеты), низшие грибы (фикомицеты) и высшие грибы (собственно грибы или эумицеты) (Табл.3).Тело гриба состоит из тонких (диаметром около 5 мкм) нитей, называемых гифами, которые, переплетаясь, образуют мицелий. В зависимости от строения гифов грибы подразделяют на низшие и высшие (Рис.14).

Рис.14. Вегетативные гифы грибов: А -у фикомицетов гифы несептированные(не имеют поперечных перегородок); Б - септированные гифы эумицетов; В - у оомицетов гифы разделены неполными перетяжками.

Гифы грибов растут путем удлинения кончиков (апикальный рост). Различают два способа размножения грибов - половое и бесполое. Большинство грибов размножаются обоими способами. Бесполое размножение осуществляется обычно при помощи спор, путем почкования или фрагментации. Наиболее широко распространено спорообразование. На концах гиф отшнуровываются конидиоспоры и дают начало новому организму.

Половое размножение у грибов включает слияние двух ядер, образование зиготы и мейоз или редукционное деление, при котором число хромосом уменьшается до исходного (гаплоидного).

Наибольшее значение для биотехнологии имеют одноклеточные грибы - дрожжи и мицелярные - плесневые грибы.

2.4.1.2 Дрожжи

Дрожжи - внетаксономическая группа одноклеточных грибов, утративших мицелиальное строение в связи с переходом к обитанию в жидких и полужидких, богатых органическими веществами субстратах. Объединяет около 1500 видов, относящихся к аскомицетам и базидиомицетам.

Дрожжи относятся к царству грибов (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes), наилучшие углеводные субстраты для них - сахароза, глюкоза. Дрожжи встречаются в природе всюду, где есть поддающиеся сбраживанию сахаристые соки - на фруктах, на листьях, цветках, содержатся в почве, водоемах, пищеварительном тракте человека. Большинство дрожжей - сапрофиты, но встречаются и патогенные или условно патогенные формы, например, возбудитель кандидомикоза человека из рода Candida.

Для дрожжей характерно бесполое размножение почкованием. При этом на материнской клетке образуется выпуклость - почка, в которую переходит 1 ядро, после чего почка отшнуровывается.

Дрожжи рода Saccharomyces способны к спиртовому брожению - в отсутствии кислорода они используют органические вещества в качестве акцепторов электронов и продуцируют этанол. В качестве источников углерода сахаромицеты утилизируют простые сахара, поэтому для использования доступных субстратов - крахмала, зерна - их гидролизуют ферметнами (амилазами).

Рис.15. Строение дрожжевой клетки:

Кст - клеточная стенка;

Мит - митохондрия;

Ж - жировая капелька;

ПМ - плазматическая мембрана;

Яш - ядрышко;

ЭР - эндоплазматический ретикулум;

П - гранулы полифосфата.

Д - диктиосомы, одна из форм аппарата Гольджи.

Спиртовое брожение лежит в основе таких промышленных процессов как виноделие, пивоварение, хлебопечение.

Дрожжи богаты белками, их содержание может доходить до 66 %, при этом 10 % массы приходится на незаменимые аминокислоты. Дрожжевая биомасса может быть получена на отходах сельского хозяйства, гидролизатах древесины, её выход не зависит от климатических и погодных условий. Поэтому её использование чрезвычайно выгодно для обогащения белками пищи человека и корма сельскохозяйственных животных.

Дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris успешно применяют в качестве систем экспрессии эукариотических белков в генетической инженерии. биотехнология междисциплинарный генетическая инженерия

2.4.1.3 Мицелиальные грибы

Важнейшими представителями мицелиальных грибов являются грибы родов Penicillium, Aspergillus и некоторые другие. Плесени продуцируют ферменты, используемые в промышленности (амилазы, пектиназы и другие), органические кислоты лимонную, глюконовую, щавелевую, итаконовую, фумаровую (Aspergillus niger) и антибиотики - пинициллины, цефалоспорины (грибы родов Penicillium и Cephalosporium). Антибиотик гризеофульвин продуцирует нитчатый гриб Penicillium griseofulvum, антибиотик трихотецин - грибом Trichothecium roseum. Плесневые грибы применяют и в производстве сыров, например, камамбера и рокфора (грибы рода Penicillium), соевого соуса (Aspergillus oryzae).

2.4.2 Простейшие

Простейшие (Protozoa) - это одноклеточные животные организмы, их рассматривают в курсах зоологии, но благодаря своим микроскопическим размерам они являются объектом микробиологии. Простейшие являются самими многочисленными представителями мира животных и характеризуются чрезвычайным разнообразием форм и поведения. Среди них есть и фотосинтезирующие организмы (эвглена), и хищники, поглощающие за счет фагоцитоза бактерии или других простейших. Некоторые из них быстро плавают в воде, другие - прикрепляются к другим объектам.

Практическое значение простейших связано с тем, что многие из них являются возбудителями болезней человека и животных, например плазмодий малярии, дизентерийная амеба. Для биотехнологии важно, что простейшие являются важнейшим компонентом активного ила (активный ил - естественно возникший биоценоз в аэрируемых очистных сооружениях - аэротенках и биофильтрах). Поглощая большое количество бактерий, простейшие способствуют выходу бактериальных экзоферментов, концентрирующихся в слизистой оболочке и тем самым принимать участие в деструкции загрязнений. В активных илах встречаются представители четырех классов простейших: саркодовые (Sarcodina), жгутиковые инфузории (Mastigophora), реснитчатые инфузории (Ciliata), сосущие инфузории (Suctoria).

Показателем качества активного ила является коэффициент протозойности, который отражает соотношение количества клеток простейших микроорганизмов к количеству бактериальных клеток. В высококачественном иле на 1 миллион бактериальных клеток должно приходиться 10-15 клеток простейших.

Простейшие обладают разнообразными биосинтетическими возможностями и потому широко распространенными в природе. Использование простейших в этом направлении уже началось.

2.4.3 Растения

Растения (царство Plantae) как объект биотехнологии рассматривает раздел биотехнологии - фитобиотехнология. В отличие от растениеводства - отрасли сельского хозяйства, фитобиотехнология оперирует с клетками и тканями растений, а также с биологически активными молекулами растительного происхождения. Интересно, что в культуре растительные клетки являются хемогетеротрофами.

Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Для культивирования используют клетки каллуса - неорганизованной массы дифференцированных растительных клеток.

Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Скорость размножения растительных клеток невелика - время удвоения их числа равно 1-3 суткам, тогда как время удвоения бактерий или дрожжей обычно 20-30 мин. Многие из них являются практически, экономически важными продуктами и используются в фармакологической, косметической, пищевой промышленности (алкалоиды кодеин, хинин, атропин, винкристин, сердечный гликозид дигоксин, стероид диосгенин и другие). В настоящее время собрана большая коллекция клеточных культур растений из различных семейств, синтезирующие вторичные метаболиты, широко используемые в промышленности. К ним относятся: женьшень дальневосточный - источник диосгенина, диоскорея дельтовидная - стероидные гликозиды, равольфия змеиная - продуцент антиаритмического алкалоида аймалина и т.д.

Прирост клеточной биомассы в условиях in vitro и in vivo может проходить с разной скоростью. Биомасса клеток женьшеня в суспензии при выращивании в 50 литровом ферментере увеличивается на 2,0 г в литре среды за сутки, что в 1000 раз больше, чем выращивании на плантации. Учитывая высокую стоимость женьшеня (килограмм плантационного корня стоит 100-150 дол. США; цена дикорастущего корня может доходить до нескольких тысяч долларов США) биотехнологический способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма привлекателен.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:

1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения:

- традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);

- культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, изомеризации).

2. Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3. Получение безвирусных растений.

4. Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

5. Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

2.4.4 Животные

То, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, стало понятно в начале XX века, когда смогли получить и поддерживать первые клеточные культуры.

Изначально культуры клеток животных применяли для выращивания и репродукции в таких клетках вирусов. Есть вирусы, которые можно размножать в эмбрионах куриного яйца, но их спектр очень невелик. Совершенствование методик культивирования клеток животных позволило использовать их для накопления больших количеств вирусного материала с целью производства из него вакцин. Сейчас же стало возможным вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию, а также подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получают из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости одинаковы. Первое - дает возможность получения трансгенных клеток, тканей или организмов, второе - незаменимо для получения моноклональных антител.

Культуры опухолевых клеток или нормальные клетки, трансформированные in vitro, сохраняют в ряде случаев способность синтезировать специфические продукты. Несмотря на много, пока не преодоленных трудностей, показана возможность получения ряда веществ в культуре животных клеток (Табл.5).

Таблица 5. Получение биотехнологических продуктов в культуре животных клеток

Наиболее перспективным направлением клеточной инженерии является гибридомная технология. Гибридные клетки (гибридомы) образуются в результате слияния клеток с различными генетическими программами, например, нормальных дифференцированных и трансформированных клеток. Блестящим примером достижения данной технологии являются гибридомы, полученные в результате слияния нормальных лимфоцитов и миеломных клеток. Эти гибридные клетки обладают способностью к синтезу специфических антител, а также к неограниченному росту в процессе культивирования.