Рис.3. Форма и величина вирионов некоторых вирусов.
По характеру взаимодействия бактериофага с клеткой все бактериофаги делятся: на вирулентные (литические), вызывающие продуктивную инфекцию и лизис бактериальной клетки и умеренные (лизогенные), вызывающие латентную инфекцию и ассоциацию генома вируса с бактериальной хромосомой (Рис.5). Умеренные фаги, в отличие от вирулентных, не вызывают гибели бактериальных клеток и при взаимодействии с ними переходят в неинфекционную форму фага, называемую профагом. Профаг - геном фага, ассоциированный с бактериальной хромосомой. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке в неограниченном числе поколений.
Рис.4. Модель бактериофага Т2. А. Фаг с вытянутым чехлом до адсорбции. Б. Фаг с сократившимся чехлом после адсорбции и инъекции.
Бактериальные клетки, содержащие в своей хромосоме профаг, называются лизогенными. Профаг в лизогенных бактериях самопроизвольно или под влиянием различных индуцированных агентов может переходить в вегетативный фаг. В результате такого превращения бактериальная клетка лизирует и продуцирует новые фаговые частицы. В ходе лизогенизации бактериальные клетки могут дополнительно приобретать новые признаки, детерминируемые геномом вируса. Такое явление - изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага -- называется фаговой, или лизогенной, конверсией (проявление вирус-индуцироанной трансформации).
Исключение фаговой ДНК из бактериальной хромосомы под действием, например мутагенов, приводит к переходу в литический цикл и репродукции фаговых частиц.
Рис.5. Жизненные циклы умеренного фага (на примере фага E.coli): включение ДНК фага в ДНК хозяина и исключение, приводящее к лизису клетки.
Умеренные фаги, неспособные ни при каких условиях переходить из профага в вегетативный фаг (образовывать зрелые фаговые частицы), называются дефектными, чаще это происходит в результате нарушения стадии сборки вирусных частиц. Некоторые умеренные фаги называются трансдуцирующими, поскольку с их помощью осуществляется один из механизмов генетической рекомбинации у бактерий - трансдукции. Такие фаги могут использоваться, в частности, в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК и/или приготовлении рекомбинантных (генно-инженерных) вакцин.
Наиболее широко вирусы применяют в вакцинном производстве и в генетической инженерии, где они используются в качестве векторов для внесения чужеродной ДНК, несущей нужный ген, в клетку-хозяина.
Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования больных людей. Однако чаще всего их используют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний. Лечебное и профилактическое действие фагов основано на их литической активности.
Отличительной чертой бактериофагов как терапевтических средств является почти полное отсутствие у них побочного действия. В настоящее время используются бактериофаги: сальмонеллезный, брюшнотифозный, дизентерийный, протейный, синегнойный, холерный, стафилококковый, стрептококковый, коли-фаг (кишечной палочки) и др.
2.3 Бактерии
Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. Рассмотрение их будет более подробным. Все бактерии делятся на две группы - эубактерии (собственно бактерии) и архебактерии, имеющие по некоторым данным более раннее происхождение, чем эубактерии. Для большинства архебактерий характерна способность расти в экстремальных условиях - при высоких температурах, низких значениях рН, концентрированных растворах соли. Ряд биохимических свойств сближает архебактерии с эукариотами, есть у них и уникальные свойства, поэтому архебактерии выделены в отдельную группу.
2.3.1 Таксономия бактерий
Бактерии имеют клеточное строение (Рис.6), размер клеток в среднем 1Ч5 мкм. В цитоплазме (клеточное пространство, заполненное водным раствором - цитозолем) находится зона нуклеоида, состоящая на 80% из ДНК, 20% приходится на белки и РНК. Наследственная информация в бактериальной клетке содержится в кольцевой молекуле ДНК - единственной хромосоме, которая не окружена мембраной, т.е. ядро отсутствует. В клетках присутствуют небольшие кольцевые молекулы нехромосомной ДНК - плазмиды, несущие необязательную для выживания клетки информацию. Чаще это гены устойчивости к антибиотикам или способности использовать определенные субстраты. Плазмиды реплицируются автономно от хромосомы.
Рис.6. Схема строения бактериальной клетки.
Цитоплазма окружена важнейшей клеточной структурой - цитоплазматической мембраной, представляющей собой двойной слой липидов, в который погружены интегральные белки (в область одного липидного слоя), периферические белки примыкают к поверхности мембраны, трансмембранные белки пронизывают бислой (Рис.7). Функции цитоплазматической мембраны - транспорт питательных веществ внутрь клетки и продуктов метаболизма наружу, а также получение энергии в виде АТФ. Цитоплазматическая мембрана вместе с цитоплазмой называется протопластом.
В цитоплазме находятся рибосомы - комплексы рибосомальной РНК и белка - на рибосомах происходит биосинтез белка на матрице матричной РНК. В клетках бактерии могут присутствовать включения запасных веществ, выросты цитоплазматической мембраны.
Рис.7. Жидко-мозаичная модель строения плазматической мембраны.
Структуры, расположенные снаружи цитоплазматической мембраны, называются поверхностными структурами. К поверхностным структурам относятся клеточная стенка, капсула, чехол, жгутики, ворсинки (Рис.6). Важнейшим компонентом клетки является клеточная стенка, выполняющая функции пограничного механичного барьера. Все многообразие бактерий по строению клеточной стенки делится на две большие группы, отнесение к которым определяется окрашиванием по Граму. Было обнаружено, что если фиксированные клетки эубактерий обработать сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс. При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса различна: у так называемых грамположительных видов этот комплекс удерживается клеткой, и последние остаются окрашенными, у грамотрицательных видов, наоборот, окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются. (Этот способ был впервые предложен в 1884 г. датским ученым Х. Грамом (Ch. Gram), занимавшимся окрашиванием животных тканей. Позднее он был использован для бактерий).
Окраска по Граму позволяет отличить бактерии, чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана (грамположительные), от бактерий, чья клеточная стенка помимо тонкого слоя пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов (грамотрицательных) (Рис.8). Основный краситель (например, кристаллический фиолетовый) прочно фиксируется в стенке грамположительных бактерий, придавая им иссиня-черный цвет, и легко вымывается спиртом (или ацетоном) из стенки грамотрицательных бактерий, после чего они докрашиваются контрастным красителем (например, сафранином) в красный цвет.
Муреин - пептидогликан бактериальных клеточных стенок построен из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, к последнему присоединена тетрапептидная боковая цепь из L-аланина, D-глутаминовой кислоты, L-лизина или мезо-(или LL-)диаминопимелиновая кислоты и D-аланина. Диаминокислоты играют важную роль в межмолекулярных сшивках, так как образуют пептидные связи с участием обеих аминогрупп. Тетрапептидные боковые связи всех дисахаридных единиц связаны с соседними цепями при помощи поперечных пентапептидных мостиков из глицина. Таким образом, образуется гигантская мешкообразная молекула - муреиновый мешок.
Рис.8. Строение клеточной стенки грамположительных (А) и грамотрицательных бактерий (Б). 1 - цитоплазматическая мембрана, 2 - пептидогликан, 3 - периплазматическое пространство, 4 - наружная мембрана, 5 - цитоплазма (в центре ДНК).
Для быстрой идентификации бактерий используют Определитель бактерий Берги, выпускаемого периодически Обществом американских бактериологов с привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий. Первое издание Определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д.X. Берги (D.H. Bergey, 1860-1937), девятое издание в 4 томах вышло в 1984-1989 гг. Признаки, по которым осуществляется разделение на группы, следующие:
- морфологические (форма клетки (Рис.9), наличие или отсутствие жгутиков, капсулы, способность к спорообразованию, особенности внутриклеточного строения, окрашивание по Граму);
- культуральные (признаки, выявляемые при культивировании в лаборатории чистой культуры бактерии);
- физиолого-биохимические (способы получения энергии, потребности в питательных веществах, отношение к факторам внешней среды, нуклеотидный состав и последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, наличие и характер минорных оснований в ДНК, нуклеотидный состав рибосомальной РНК, последовательность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функциями).
-
Рис.9. Формы бактерий.
А - микрококки, б - стрептококки, в - сарцины, г - диплококки и тетракокки, д - стафилококки, е - палочки, ж - спороносные палочки.
В девятом издании Определителя бактерий Берги все обнаруженные организмы, отнесенные к царству бактерий, разделены на 35 групп, относящихся к 4 секциям - 1) Грамотрицательные бактерии, имеющие клеточную стенку (Gracilicutes); 2) Грамположительные бактерии, имеющие клеточную стенку (Firmicutes); 3) Эубактерии, не имеющие клеточной стенки (Tenericutes); 4) Архебактерии (Mendosicutes).
Представленная в Определителе бактерий Берги система классификации является строго идентификационной и не решает задачи выявления эволюционных связей между прокариотами. Для установления степени родства между прокариотными организмами разработаны методические подходы, позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции. Общепринятой мерой эволюционного расстояния между организмами служит количество нуклеотидных замен в молекулах сравниваемых рРНК. Наиболее удобным оказался анализ молекул рРНК средней величины: 16S (у прокариот) и 18S (у эукариот), состоящих из 1600 и 2500 нуклеотидов соответственно. Как показал анализ нуклеотидного состава 16S рРНК, эволюция живых организмов протекала от прокариот к эукариотам, причем эубактерии и архебактерии - отдельные ветви эволюции (Рис.10).
2.3.2 Генетическая изменчивость бактерий
Бактерии размножаются бинарным делением, которому предшествует репликация (удвоение) бактериальной хромосомы. В результате образуются две одинаковые дочерние клетки. При этом дочерние клетки являются полными копиями родительской клетки. Как же осуществляется процесс эволюции у бактерий, ведь меняющиеся условия среды диктуют необходимость изменений и адаптации для сохранения жизнеспособности. Такие изменения могут быть результатом мутаций (мутация - стойкое (то есть такое, которое может быть унаследовано потомками данной клетки или организма) изменение генотипа, происходящие под влиянием внешней или внутренней среды.
Рис.10. Классификация организмов по нуклеотидному составу 16S рРНК.
Процесс возникновения мутаций получил название мутагенеза). Передача генетического материала между бактериями может происходить в результате конъюгации, трансформации и трансдукции (Рис.11).
Конъюгация - направленный перенос генетического материала путем прямого контакта между клетками. ДНК переносится из клетки донора в клетку реципиента через ворсинки F-пили. Биологическая значимость этого процесса стала проясняться после внедрения в медицинскую практику антибиотиков. Устойчивость к антибиотикам можно получить в результате мутации, что происходит один раз на каждые 106 клеточных делений. Однако, однажды изменившись, генетическая информация может быстро распространяться среди сходных бактерий благодаря конъюгации, поскольку каждая третья из близкородственных бактерий способна именно к этому типу генетического переноса. Для реализации процесса необходим F-фактор - плазмида, кодирующая информацию, необходимую для конъюгации.
Рис.11. Механизмы переноса бактериальной ДНК. Конъюгация (А), трансформация с использованием отдельной молекулы ДНК (Б), трансдукция с помощью фагов (В).
Конъюгация требует наличия двух типов клеток: доноров (F+), обладающих F-фактором, и реципиентов (F-), не обладающих им. При скрещивании клеток F- и F+ фактор фертильности передаётся с частотой, близкой к 100%.
Фактор переноса содержит гены специальных и необходимых при конъюгации структур -- F-пилей и ряд других генов, вовлечённых в процесс взаимодействия с F-клетками.
Первый этап конъюгации -- прикрепление клетки-донора к реципиенту с помощью F-пилей. Затем между клетками формируется конъюгационный мостик, через который передаётся F-фактор, а также и другие плазмиды, автономно пребывающие в цитоплазме донора. При попадании F-фактора в реципиентную клетку она становится F+ и приобретает способность передавать фактор фертильности другим F-клеткам. Подобный механизм обеспечивает приобретение популяционной устойчивости к антибактериальным агентам.