Учебное пособие: Основы биотехнологии

Рис.22. Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках.

Химико-ферментативный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного соединения нуклеотидов, обычно 8-16-звенных, которые затем с помощью ферментов нуклеинового обмена (ДНК-лигаза, ДНК-полимеразы и др.) превращаются в двухцепочечные фрагменты ДНК. В настоящее время такой синтез осуществляют в автоматических синтезаторах олигонуклеотидов по заданной программе.

Ферментативный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК).

Наиболее актуальным в биотехнологии является получение эукариотических белков, таких как инсулин, интерфероны, соматотропин, с использованием прокариотических продуцентов, растущих быстро и использующих доступные субстраты. Проблема экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот заключается в сложном строении эукариотических генов, которые содержат участки, кодирующие белки (экзоны) и интроны - неинформативные участки, вырезаемые после транскрипции в процессе сплайсинга РНК. Поскольку у прокариот механизм сплайсинга отсутствует, для получения нужного гена используют мРНК, содержащую только информативные участки. Схема получения из мРНК фрагмента ДНК, пригодного для клонирования, представлена на Рис.23.

Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3'-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.

Рис.23. Схема получения из мРНК фрагмента ДНК, пригодного для клонирования.

Этот метод является в настоящее время наиболее распространенным методом получения эукариотических генов для экспрессии их в клетках прокариот.

3.2.2.2 Встраивание полученного гена в вектор

Рассмотрим процесс получения бактериального штамма, способного к экспрессии чужеродного (например, эукариотичекого) гена. Если очищенную кольцевую плазмиду pBR322 обработать рестриктазой BamH1, расщепляющей ее в единственном сайте, расположенном в гене устойчивости тетрациклину, то образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с донорной (чужеродной) ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТФ, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности объединившиеся между собой фрагменты донорной ДНК и исходные плазмидные ДНК (Рис.24). Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены осуществляют уже после клонировании в клетках E. coli.

Рис.24. Схема встраивания клонируемых фрагментов ДНК в плазмиду pBR322.

3.2.2.3 Введение рекомбинантной ДНК в организм-реципиент

Гибридную плазмиду вводят в E. coli, которая при размножении образует клон, все клетки которого содержат рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной клетке и индуцирует в ней синтез белка.

Для клонирования ДНК используют так называемые пермиссивные клетки (от англ. Permission - разрешение). Особенности пермиссивных клеток:

1. Внутриклеточные нуклеазы не разрушают включаемую ДНК или РНК.

2. Вектор способен реплицироваться в пермиссивной клетке.

3. Выраженная активность промотора и/или терминатора транскрипции рДНК.

4. Сплайсинг РНК.

5. Наблюдается эффективная трансляция мРНК.

6. Нет выраженной активности пептидогидролаз, катализирующих гидролиз экспрессируемых чужеродных белков.

Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются методами трансформации, инфекции, микроинъекций, электропорации. Ввод рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией. Для ее осуществления используют специально разработанные приемы, например, обрабатывают клетки бактерий полиэтиленгликолем или хлористым кальцием на холоду. Обработанные таким образом клетки бактерий, подготовленные к трансформации, называются компетентными. Однако эффективность трансформации все же остается невысокой, обычно трансформируется не более одной клетки из тысячи. Таким образом, большинство клеток после проведения трансформации не содержат рекомбинантной ДНК.

Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последовательностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов называют трансфекцией. Метод микроинъекции используют в случаях механического введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные микроиглы с диаметром отверстия 0,1-0,5 мкм. В некоторых случаях применяют упаковку рекомбинантной ДНК в липосомы (полые частицы, содержимое которых ограничено липидной мембраной). Заключенные в липосомы ДНК защищены от нуклеаз, легко проникают в клетки в результате слияния липосом и мембраны клеток или при поглощении их путем фагоцитоза.

Электропорация - перенос генетического материала через мембранные поры, образующиеся в результате воздействия на клетку высоковольтного импульса (350 В, 54 мс).

Для трансформации растительных клеток используют бомбардировку микрочастицами золота или вольфрама с адсорбированным на них генетическим материалом. Частицам сообщается кинетическая энергия, достаточная для прохождения через клеточные стенки.

3.2.2.4 Идентификация и отбор клеток, которые приобрели нужный ген

В системе pBR322, в которой чужеродная ДНК встраивается в сайт BamHI (в гене tet, см. Рис.18), специфическая идентификация состоит из двух этапов. Сначала клетки после трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин. В таких условиях могут вырасти только те клетки, в которых присутствует интактный ген bla - или в составе интактной плазмиды pBR322, или в составе гибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чувствительны к ампициллину. Сайт BamHI расположен в гене tet плазмиды pBR322, встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую последовательность, и устойчивость к тетрациклину утрачивается. Таким образом, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду pBR322, несут ген tet и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину.

На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки (Рис.25).

Рис.25. Перенос клеток со среды с ампициллином на среду с тетрациклином методом перепечатки.

Клетки, не выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду pBR322. Среди колоний, выросших на среде с ампициллином, выделяют те, которые оказались чувствительны к тетрациклину, и из каждой колонии получают индивидуальные клеточные клоны или (чаще делают именно так) объединяют все колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к тетрациклину, и культивируют их вместе.

3.2.3 Получение рекомбинантного инсулина

Инсулин -- гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Дефицит этого гормона в организме приводит к сахарному диабету. Инсулин -- небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника -- препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей (Рис.). После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Рис.26. Первичная структура инсулина человека.

Первичная структура инсулина у разных биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении B-цепи свиного инсулина расположен аланин, а в инсулине человека -- треонин; бычий инсулин отличается тремя аминокислотными остатками. Первые лекарственные препараты инсулина были на основе животного инсулина, однако такие препараты вызывали у больных аллергические реакции и другие побочные эффекты. В 1972 г. был разработан метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением остатка аланина на остаток треонина. В результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 % чистоты. Ограничения использования этого метода связаны с ограниченностью сырьевой базы - поджелудочной железы телят и свиней, поскольку для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг исходного сырья.

Рис.27. Структура инсулина человека: А) структура проинсулина; Б) третичная структура инсулина.

Поскольку известна структура инсулина, можно рассматривать синтетический метод получения инсулина. Синтез обеих цепей, включающий 170 химических реакций, в 1963 г. был реализован в США, ФРГ и Китае. Но перенести такой сложный процесс в промышленность оказалось невозможным.

В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли в-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной транскриптазы получили рДНК (см. раздел ). Полученную рДНК встроили в плазмиду pBR322 Е. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы (см. раздел 4.2.2.1). Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина. В генетической инженерии в качестве системы экспрессии эукариотических генов используют бактерии Esherichia coli и Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris, линии клеток млекопитающих, трансгенные животные. Исторически первыми были выбраны бактерии E. coli, которые имеют как преимущества, так и недостатки (Табл.7).

Таблица 7. Преимущества и недостатки Esherichia coli в качестве системы экспрессии эукариотических генов

В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который выщепляли из такого белка трипсином (Рис.28).

Рис.28. Биосинтез инсулина крысы в сконструированных клетках E. coli: а) карта плазмиды pBR322; б) карта, полученная при определении последовательности рДНК рекомбинантной плазмиды в продуцирующем инсулин клоне E. coli; в) гибридный белок; г) биологически активный инсулин после удаления пенициллиназы и сегмента проинсулина.

Рекомбинантный белок синтезировался бактериями внутриклеточно в виде так называемых телец включения (inclusion bodies), которые представляют собой агрегаты целевого белка в денатурированном неактивном состоянии (Рис.29). Благодаря этому целевой белок, находясь в нерастворимом состоянии, не подвергается протеолизу цитоплазматическими ферментами.

Процесс получения инсулина включал следующие стадии (подробнее см. раздел):

1. Ферментация (выращивание штамма-продуцента в ферментере);

2. Отделение биомассы (клеток продуцента) методом центрифугирования;

3. Разрушение клеток с выделением телец включения;

4. Очистка рекомбинантного белка.

Рис.29. Микрофотография клеток Е. coli с тельцами включения.

Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин на основе различных современных модификаций генно-инженерного метода. Из 1000 литров бактериальной культуры получают приблизительно 200 г инсулина, что равно количеству, получаемому из 1600 кг поджелудочной железы животных. Параллельно была решена проблема иммунологического поражения организмов диабетиков животным инсулином.