Производство и продажу инсулина впервые начала американская фирма Eli Lilly (США). Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400 млн. долларов, ежегодное потребление около 5000 кг.
4. Основные этапы биотехнологического процесса
В биотехнологии биологические объекты (продуценты) выращивают в условиях, оптимальных для биосинтеза целевых продуктов - культивируют. На первом этапе - предферментационном (Рис.30) - готовят питательную среду для культивирования продуцента, стерилизуют ее для полного удаления жизнеспособной посторонней микрофлоры, получают инокулят - посевную дозу продуцента, моют и стерилизуют оборудование для культивирования.
Основная стадия биотехнологического производства - стадия культивирования продуцента или ферментации (биотрансформации) (Рис.30). На этой стадии происходит рост продуцента и биосинтез целевых продуктов. Используют разные технологии культивирования - в жидкой питательной среде (глубинное культивирование) и на твердой питательной среде (поверхностное культивирование). Основным продуктом стадии глубинной ферментации является культуральная жидкость - суспензия клеток продуцента в питательной среде, содержащей растворимые продукты метаболизма (метаболизм - обмен веществ, химические превращения, протекающие от момента поступления питательных веществ в живой организм до момента, когда конечные продукты этих превращений выделяются во внешнюю среду). Целевой продукт может содержаться как в клетках (биомассе), так и в растворе (внеклеточные продукты). Этими вариантами определяется схема выделения и очистки продукта. Приведенная на Рис.30 схема иллюстрирует биотехнологический процесс.
Рассмотрим отдельные стадии биотехнологического процесса. Предферментационный этап складывается из следующих этапов:
1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.
2. Приготовление посевной микробной культуры.
3. Приготовление и стерилизация питательных сред.
4. Подготовка биореактора к посеву.
Исходные ростовые вещества (субстраты).
Ростовые вещества используют в составе питательной среды, который подбирают таким образом, чтобы присутствовали все химические элементы для построения клетки в такой форме, в которой продуценты способны их усваивать. Количественный состав питательной среды зависит от многих факторов, главным из которых является стехиометрия клеточного роста. Основой конструирования питательных сред является простой материальный баланс превращения в процессе биосинтеза низкомолекулярных субстратов, например глюкозы и аммиака, в биомассу и внеклеточные продукты. Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники углерода. Разнообразие таких источников очень велико, так как микроорганизмы потребляют широкий спектр органических соединений, начиная от простейших углеродных соединений, таких как метан, метанол, диоксид углерода, моносахариды и заканчивая природными биополимерами. Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста нуждаются в источниках азота, фосфора, макро- и микроэлементов (калии, магнии. цинке, железе, меди, молибдене, марганце и др.). Как правило, эти компоненты заранее вносятся в питательные среды в виде минеральных солей перед началом ферментации. Исключение составляют газообразные компоненты.
Для культивирования микроорганизмов используют специальные питательные среды, которые должны содержать необходимые питательные вещества и являться оптимальной средой обитания микроорганизмов.
Универсальных сред, пригодных в равной степени для всех микроорганизмов, не существует. В закономерности от особенностей обменных процессов (фотосинтез, способы получения энергии) отдельным видам микроорганизмам требуются различные составы питательных веществ.
Рис.30. Принципиальная схема биотехнологического процесса.
По составу питательные среды подразделяются на 2 группы - натуральные и синтетические.
Натуральными называются среды, которые состоят из натуральных пищевых продуктов (молоко, яйца, мясо). Большинство из них применяют в виде экстрактов или настоев. Эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав. Они используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. Примерами служат мясопептонный бульон, почвенная вытяжка, картофельная среда. Среди натуральных сред широкое применение нашли: меласса - отход свеклосахарного производства, применяется как основной источник углерода, кукурузный экстракт, отруби и др.
Синтетические среды - это среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ. В большинстве случаев синтетические среды готовят на водопроводной воде и микроэлементы не добавляют.
По физическому состоянию различают: жидкие, плотные, сыпучие среды.
Жидкие среды широко применяют в биотехнологии для культивирования продуцентов. Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение изолированных колоний) для хранения культур, количественного учета микроорганизмов. Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатину и кремнекислый гель. Агар-агар - сложный полисахарид, получаемый из морских водорослей. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не использует его в качестве питательного субстрата. В воде агар-агар образует гели которые плавятся при 1000С, а затвердевает при 400С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы при любой подходящей для их роста температуре.
Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии. К ним относятся: отруби, кварцевый песок, разваренное пшено.
Стерилизация питательных сред, оборудования и воздуха.
Стерилизация всех компонентов биотехнологического процесса, соприкасающимися с чистыми культурами микроорганизмов - важнейший этап. Под стерилизацией понимают полное удаление жизнеспособных организмов, что достигается двумя группами методов. Первая группа основана на воздействии летальных факторов - высокой температуры, ионизирующего излучения, химических веществ, вторая - на механическом отделении посторонних микроорганизмов (контаминантов) - стерилизующая фильтрация, герметизация аппаратов, коммуникаций, арматуры. Основным методом очистки и стерилизации воздуха, огромные объемы которого используют в процессе ферментации, является пропускание через фильтры - стерилизующая фильтрация. Для стерилизации жидких питательных сред и оборудования чаще применяют термическую стерилизацию. Большие перспективы для стерилизации жидких питательных сред имеет микрофильтрация. Также применяют химическую деконтаминацию и ионизирующее излучение, когда другие методы не могут быть использованы.
Для стерилизации оборудования применяют термическую стерилизацию паром под давлением 1 ати (121оС).
Подготовка инокулята.
Для сокращения лаг-фазы (непродуктивной фазы задержки роста, см. раздел 3.3.3) количество посевного материала, передаваемого в основной ферментер, может варьировать в разных производствах от 5 до 20% объема среды культивирования в нем. Накопление производственной культуры проводят за 2 - 6 этапов. Для этого используется ряд так называемых посевных аппаратов, рабочий объем которых каждый раз увеличивается, как правило, в 10 раз. Размер посевных аппаратов для разных производств различен и может варьировать от 10 л до 50 м3
Ферментация.
Культивирование (ферментация) является основной стадией биотехнологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства продуктов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов. Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой - антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.
В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, такой способ культивирования называют поверхностным.
При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а кислород поступает к клеткам в результате интенсивной аэрации и перемешивания.
Аппараты для глубинного культивирования называют ферментерами (ферментаторами), конструкции их очень разнообразны. На Рис.31 представлен ферментер для периодического культивирования - питательная среда и все компоненты загружаются сразу и до окончания культивирования в ферментер ничего не добавляется и не выводится (кроме воздуха - источника кислорода). Его конструкция обеспечивает стерильность ферментации в течение длительного времени (несколько суток) при оптимальных условиях для роста и жизнедеятельности продуцента. Ферментеры такой конструкции изготавливают объемом от 1,25 до 160,0 м3. Как видно из рисунка, это цилиндрический вертикальный аппарат со сферическим днищем, снабженный аэрирующим, перемешивающим и теплопередающим устройствами. Воздух для аэрации поступает в ферментер через барботер, установленный под нижним ярусом мешалки.
Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор подают стерильную питательную среду, вносят посевной материал, включают систему аэрации и перемешивающее устройство.
Рис.31. Ферментер периодического действия: 1- турбинная трехъярусная мешалка, 2 - охлаждающий змеевик, 3 - секционная рубашка, 4 - отражательная перегородка, 5 - барботер, П-пар; I -XI - материальные и вспомогательные трубопроводы с запорно-регулирующими устройствами (I - посевная линия, II - подача стерильного сжатого воздуха, III - подача пара, IV - удаление отработанного воздуха, V - загрузочная линия, VI - линия введения добавок, VII - подача пеногасителя, VIII - подача моющего раствора, IX - пробоотборник, X - выдача продукта, XI - выдача в канализацию через нижний спуск).
Температуру культивирования поддерживают путём подачи охлаждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппарата. Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С. Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культивирования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, кислоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48 ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов.
Процесс культивирования контролируют по следующим параметрам - температура, давление, рН, расход воздуха, частота вращения мешалки, а также путём периодического отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса). В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого продукта, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микрофлоры.
Выделение и очистка продукта.
Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многокомпонентную систему. В водной фазе содержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, неутилизированные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира, пузырьки воздуха, мел. В свою очередь водная фаза культуральной жидкости (нативный раствор) включает большое число органических и неорганических веществ, коллоидных фракций белков, сухой остаток культуральной жидкости - до 17% и более. Содержание биомассы в культуральной жидкости достигает 8-10%. Концентрация целевого продукта чаще всего не превышает 1,5%, что составляет менее 10% сухого остатка. В зависимости от целевого назначения конечного продукта (для здравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и др.) используются схемы производства различной степени сложности, при этом учитывают и место накопления целевого продукта - внутриклеточно, в биомассе или внеклеточно - в культуральной жидкости.
При локализации продукта в биомассе для ее выделения применяют такие методы, как седиментацию и декантацию, фильтрование, центрифугирование, отстаивание, флотацию. Если целевым продуктом является внеклеточный метаболит, его выделяют из культуральной жидкости методами экстракции, сорбции, осаждения, хроматографии, с применением мембранных методов - ультрафильтрации, диализа, обратного осмоса.
5. Вопросы для подготовки к зачету
1. На какие науки опирается, и по каким направлениям развивается биотехнология?
2. Основные цели и задачи биотехнологии.
3. Какие методы используют биотехнологи для достижения целей и задач биотехнологии?
4. Отличие биотехнологии от традиционной химической технологии.
5. Объекты (продуценты) биотехнологических исследований.
6. Биотехнологический процесс и его компоненты.
7. Основные этапы биотехнологического производственного процесса.
8. Приведите примеры наиболее часто используемых в биотехнологических производствах микроорганизмов-продуцентов. Какие продукты с их помощью получают?
9. Классификация живых организмов по царствам и надцарствам.
10. Какие организмы-эукариоты относят к микроорганизмам?
11. Какие организмы относят к микроорганизмам? Их преимущества при использовании в качестве продуцентов в биотехнологическом процессе?
12. Чем занимается наука систематика (таксономия)?
13. Перечислите основные различия между прокариотами и эукариотами. Подробно объясните различия, касающиеся а) формы клеток, б) локализации генетического материала.