Учебное пособие: Основы биотехнологии

Трансформация - передача генов при помощи свободной растворимой ДНК, выделенной из клеток-доноров. Клетки поглощают любую ДНК, но включаться в геном может только ДНК, содержащая последовательности, гомологичные последователям ДНК реципиента. Погибшие бактерии постоянно высвобождают ДНК, которая может быть воспринята другими бактериями. Как правило, любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется эндонуклеазами, но при некоторых условиях такая ДНК может быть включена в геном бактерии. По происхождению ДНК может быть плазмидной либо хромосомной и нести гены, «трансформирующие» реципиента. Подобным путём в популяции могут быть распространены гены, кодирующие факторы вирулентности. В обмене генетической информацией трансформация играет незначительную роль.

Стадии трансформации бактерии.

Трансформация протекает в три стадии:

1) адсорбция двуцепочечной ДНК на участках клеточной стенки компетентных клеток;

2) ферментативное расщепление связавшейся ДНК в некоторых случайно расположенных местах с образованием фрагментов 4-5*10⁶ D;

3) проникновение фрагментов ДНК с молекулярной массой не менее 5*10⁶ D, сопровождающееся разрушением одной из цепей ДНК (последний этап энергозависим). Проникшая цепь ДНК рекомбинирует с генетическим материалом реципиентной клетки.

Трансдукция - передача участков бактериальной ДНК от клетки-донора клетке реципиенту при участии бактериофагов. В клетке, инфицированной бактериофагом, в ходе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов вместе с вирусной ДНК могут проникнуть фрагменты бактериальной ДНК или плазмиды. Вирусы ограничены в объёме генетического материала в соответствии с объёмом головки. Если ДНК бактериальной клетки расщепляется фагом в нетипичном месте, то чтобы освободить пространство для фрагмента хромосомной ДНК, некоторые участки вирусных ДНК «приносятся в жертву», что приводит к утере определённых их функций. При этом фаговая частица может стать дефектной. Количество аномальных фагов может достигать 0,3% всей дочерней популяции. Образовавшийся фаг и есть частица, вызывающая неспецифическую (общую) трансдукцию. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены.

2.3.3 Рост бактерий

Для интенсивного роста бактериям необходимы определенные условия: необходимые питательные вещества в соответствии с типом питания в водном растворе, температура, рН среды, кислород воздуха (для аэробных бактерий). Если внести бактерии в питательную среду и создать необходимые условия, они будут расти до тех пор, пока не исчерпаются питательные вещества или образуются ингибирующие рост продукты. Рост клеток без добавок свежей питательной среды и удаления продуктов (кроме воздуха) называют периодической культурой. Зависимость логарифма количества живых клеток от времени называется кривой роста, которая имеет S-образную форму (Рис.12). На кривой роста выделяют несколько фаз., сменяющих друг друга в определенной последовательности и в большей или меньшей степени выраженных: начальную (или лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу отмирания. В лаг-фазе клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов.

Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость во время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от среды. Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин, Escherichia coli при 37°С - примерно каждые 20 мин. У других бактерий время генерации значительно больше: у многих почвенных видов оно достигает 60-150 мин, а у Nitrosomonas и Nitrobacter - даже 5-10 ч. Концентрация клеток Х экспоненциально зависит от времени (уравнение 1).

(1)

где Х_О - начальная концентрация бактерий (клеток/мл или г биомассы/мл); - удельная скорость роста, ч^-1; t - время культивирования.

Рис.12. Фазы роста бактерий в периодической культуре I- лаг-фаза, II - логарифмическая фаза, III- фаза замедленного роста, IV - стационарая фаза, V - фаза отмирания. Х - концентрация клеток, 10⁶кл/мл.

Удельная скорость роста - параметр, рассчитываемый как отношение скорости прироста биомассы (клеток бактерий) к концентрации биомассы (уравнение 2) и может быть рассчитана как тангенс угла наклона линеаризованной (экспоненциальной) части кривой роста (в полулогарифмических координатах, Рис.11).

(2)

Время генерации t_d (время между делениями клеток) связано с удельной скоростью роста уравнением (3).

(3)

Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата - при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за недостатка 0₂ или накопления токсичных продуктов обмена; все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе. В стационарной фазе достигается динамическое равновесие между гибнущими и лизирующими клетками и бактериями, сохраняющими жизнеспособность за счет продуктов обмена, выделяющихся в результате лизиса.

Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования.

Фаза отмирания характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции.

Наибольшую концентрацию биомассы, достигаемую в стационарной фазе роста, называют выходом или урожаем (). Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования. Для биотехнолога важно определить время окончания культивирования. Оно зависит от природы и механизма образования целевого продукта. Если целевыми продуктами являются собственно биомасса продуцента, внутриклеточные продукты или внеклеточные продукты, образующиеся параллельно (_актериям) с ростом клеток, наивыгоднейшим (без учета технико-экономических показателей) временем окончания является время, соответствующее максимуму средней продуктивности по биомассе (), приходящееся на время окончания экспоненциальной фазы и резкого замедления роста. Средняя продуктивность биотехнологического процесса - количество целевого продукта, полученного с единицы объема культуральной жидкости в единицу времени (формула 4).

(4)

В некоторых случаях при получении вторичных метаболитов, например антибиотиков, образование целевого продукта начинается по окончании роста клеток и достижения стационарной фазы. В этом случае оптимальное время окончания процесса увеличивается и определяется динамикой продуктивности по конкретному продукту, не связанной с продуктивностью по биомассе. Причем выход целевого продукта пропорционален накоплению биомассы.

В задачи биотехнологии во всех вариантах входит решение следующих основных проблем - сокращения непродуктивной лаг-фазы и продления экспоненциальной фазы. Сокращению лаг-фазы способствует идентичность состава питательной среды инокулята и промышленного процесса, а главное - объем инокулята должен составлять 10-15% объема промышленного культивирования.

Проблема продления экспоненциальной, самой продуктивной, фазы роста является и самой трудной. Здесь важно не допустить исчерпания питательных веществ и своевременно удалять ингибирующие рост продукты метаболизма.

2.3.4 Бактерии как продуценты в биотехнологии

Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. С помощью бактерий получают вино, молочные продукты, закваски и другие пищевые продукты, ацетон и бутанол, этанол, уксусную и лимонную кислоты, витамины, ряд ферментов, антибиотики и каротиноиды. Бактерии участвуют в трансформации стероидных гормонов. Их используют для получения белка и ряда аминокислот. Применение бактерий для переработки отходов в биогаз или этанол даёт возможность создания принципиально новых возобновляемых энергетических ресурсов. Бактерии используют для извлечения металлов (в т.ч. золота), увеличения нефтеотдачи пластов. Благодаря бактериям и плазмидам стало возможным развитие генетической инженерии. Изучение бактерий сыграло огромную роль в становлении многих направлений биологии, в медицине, агрономии и др. Велико их значение в развитии генетики, т.к. они стали классическом объектом для изучения природы генов и механизмов их действия. С бактериями связано установление путей метаболизма различных соединений и др.

Потенциал бактерий в практическом отношении неисчерпаем. Углубление знаний об их жизнедеятельности открывает новые направления эффективного использования бактерий в биотехнологии и других отраслях промышленности.

Производственные штаммы микроорганизмов должны соответствовать определенным требованиям: способность к росту на дешевых питательных средах, высокая скорость роста и образования целевого продукта, минимальное образование побочных продуктов, стабильность продуцента в отношении производственных свойств, безвредность продуцента и целевого продукта для человека и окружающей среды. В связи с этим все микроорганизмы, используемые в промышленности проходят длительные испытания на безвредность для людей, животных и окружающей среды. Важным свойством продуцента является устойчивость к инфекции, что важно для поддержания стерильности, и фагоустойчивость - устойчивость к заражению бактериофагами. Примеры использования бактерий в биотехнологии приведены в Табл.2.

Таблица 2. Бактерии - продуценты важнейших биотехнологических продуктов

2.4 Эукариоты

Эукариоты, или Ямдерные (лат. Eucaryota от греч. еэ- - хорошо и кЬсхпн - ядро) - надцарство живых организмов, клетки которых содержат ядра (см. Рис.2). Все организмы, кроме вирусов и бактерий, являются ядерными. В ядре содержится генетическая информация (ДНК) и осуществляются процессы репликации (удвоение молекул ДНК), транскрипции (синтез молекул РНК на матрице ДНК) и процессинг РНК с образованием мРНК (см. раздел 4.2.1). В специальном образовании внутри ядра - ядрышке - происходит синтез рибосомальной РНК (рРНК).

Животные, растения, грибы, а также группы организмов под общим названием протисты (простейшие) - все являются эукариотическими организмами. Они аэробны, могут быть одноклеточными и многоклеточными, но все имеют общее строение клеток. В отличие от клеток бактерий у эукариотов в клетках присутствуют органеллы, отделенные от цитоплазмы одной или двумя мембранами. К двумембранным органеллам относятся митохондрии и пластиды, а также клеточное ядро. Одна мембрана ограничивает эндоплазматический ретикулум (ЭР), комплекс Гольджи, лизосомы. Такое выраженное подразделение цитоплазмы на множество обособленных пространств называется компартментализацией. Ряд клеточных органелл (рибосомы, центриоли) не окружены мембранами.

Митохондрии - важнейшие органеллы, в которых осуществляется окисление органических веществ до диоксида углерода и воды и аккумулирование выделяющейся энергии в виде АТФ. У растений также присутствуют пластиды, например хлоропласты - пластиды зелёного цвета, содержащие хлорофилл. В хлоропластах происходит фотосинтез.

Эндоплазматический ретикулум образует в цитоплазме каналы, по которым осуществляется транспорт веществ. ЭР, примыкающий к ядру, покрыт рибосомами, белковонуклеиновыми комплексами, в которых осуществляется синтез мембранных белков, и называется шероховатым. ЭР без рибосом называют гладким.

Лизосомы - контейнеры с гидролитическими ферментами, пероксисомы - контейнеры с ферментом каталазой, разрушающей пероксид водорода.

Рис.13. Строение типичной клетки животного. Отмеченные органеллы: 1. Ядрышко 2. Ядро 3. Рибосома 4. Везикула 5. Шероховатый эндоплазматический ретикулум 6. Аппарат Гольджи 7. Клеточная стенка 8. Гладкий эндоплазматический ретикулум 9. Митохондрия 10. Вакуоль 11. Гиалоплазма 12. Лизосома 13. Центросома (Центриоль)

Аппарат Гольджи - органеллы в виде стопки сплющенных цистерн, от которых отделяются пузырьки и перемещаются к внешней мембране и сливаются с ней (экзоцитоз). Аппарат Гольджи (комплекс Гольджи) -- мембранная структура эукариотической клетки, органелла, в основном предназначенная для выведения веществ, синтезированных в эндоплазматическом ретикулуме. Аппарат Гольджи был назван так в честь итальянского учёного Камилло Гольджи, впервые обнаружившего его в 1898 году.