Материал: Bilet_1

пептидных цепей. На схеме показаны некоторые из известных сигнальных последовательностей и сигнальных участков. Последовательности даны с использованием однобуквенного кода для аминокислот. Например, последовательность KDEL-COO- (2) определяет сродство белка к мембране ШЭР.

Сигнальные пептиды (участки) — это структурные сигналы, которые могут быть прочитаны клеткой двумя способами. Обычно они узнаются и связываются рецепторами, локализованными в мембранах органелл. Затем рецепторы при участии белков-посредников переносят связанные белки энергозависимым образом через мембраны в соответствующие органеллы, обеспечивая селективность переноса. Кроме того, сигнальные последовательности могут служить местами узнавания для ферментов, которые модифицируют белки, существенно изменяя их свойства и дальнейшую судьбу, в качестве примера можно привести белки лизосом или мембранные белки с липидным якорем.

Сигнальные пептиды, расположенные на N- или С-концах полипептидной цепи, после выполнения своей функции удаляются специфичными гидролазами. При наличии в белке нескольких сигнальных последовательностей они удаляются поочередно. Это имеет место, например, в случае импорта белков в митохондрии и хлоропласты, когда большинству белков приходится последовательно проходить через несколько мембран.

2. Химическая модификация аминогрупп в белках.

Подробно стр. 186 учебника Степанова, стр 161 учебника Овчинникова

3. Время жизни белков в цитозоле клетки. Шапероны Hsp90.

Время жизни белков – от минут (факторы транскрипции, циклины) до дней, пока их не уничтожит протеасома.

Hsp90 – шаперон, занимающийся фолдингом, противостоящий тепловому шоку и помогающий в деградации белков. Консервативен, найден в бактериях и эукариотах (нет в археях).

Белок содержит 4 структурных домена:

Высококонсервативный N-концевой домен ~25 кДа. Содержит АТФ-связывающий карман;

Линкер с большим количеством заряженных аминокислот;

Средний домен ~40 кДа. Место связывания различных белков;

С-концевой домен ~12 кДа. Альтернативный АТФ-связывающий карман.

В открытом состоянии (АТФ связан) Hsp90 снаружи содержит гидрофобные участки и неверно фолдированные белки прекрасно с ними связываются. После связывания происходит гидролиз АТФ, изменения конформации шаперона и «зажимание» нефолдированного белка. Если белок не развернулся правильно, то Hsp90 навешивает на него убиквитиновые метки.

Билет №11 1. Импорт белков в митохондрии.

Чтобы попасть в митохондрию, белок должен иметь специальный направляющий сигнал (targeting signal). Некоторые белки, предназначенные для внутренней мембраны митохондрий или межмембранного пространства, как и белки наружной мембраны, имеют внутренние сигналы, которые еще не идентифицированы. Другие белки митохондриальной внутренней мембраны и большинство белков митохондриального матрикса синтезируются в цитозоле в виде предшественников, содержащих сигнальную последовательность из 12-70 аминокислот на N-конце (это пресиквенс). Обычно такие последовательности удаляются после импорта и называются сигнальными (транзиторными) пептидами. Это последовательности содержат много положительно заряженных аминокислот, которые могут образовывать α-спирали, в которых одна сторона заряжена положительно, а другая гидрофобна. Направляющим сигналом является, скорее, не определенная аминокислотная последовательность, а именно трехмерная структура амфифильной α-спирали.

Для импорта белка в матрикс ему необходимо пройти внутреннюю и внешнюю мембраны. Перенос белка осуществляется в так называемых сайтах транслокации, в которых обе мембраны находятся близко друг к другу. Каждая из них содержит собственный аппарат транслокации, который переносит белок в развернутом состоянии.

Белок-предшественник синтезируется на рибосомах и далее ассоциируется с шаперонами (напр., с цтБТШ70). Связывание с цтБТШ70 сопровождается гидролизом АТФ. Транспорт через внешнюю мембрану осуществляется ТОМ-комплексом, который состоит по меньшей мере из 8 различных белков. Субъединицы ТОМ20 и ТОМ22, возможно, участвуют с распознавании направляющей сигнальной последовательности. Возможно, в специфическое распознавание сигнала включены электростатические взаимодействиямежду положительно заряженной стороной α-спирали сигнальной последоваетельности и отрицательно заряженной поверхностью ТОМ22. Затем ТОМ20 и ТОМ22 участвуют в передаче полипептидной цепочки в транслокационную пору. Еще одним участником транспорта белков в митохондрии является ТОМ70. Он опосредует проникновение белка АТФ/АДФ-транслокатора и др белков-переносчиков внутренней мембраны. Такие белки содержат внутреннюю сигнальную последовательность, а не лидерную N-концевую. Возможно, что в формировании транслокационной поры участвуют также белок ТОМ40 и мелкие субъединицы ТОМ5,6,7.

Последующий транспорт через внутреннюю мембрану происходит с участием комплекса TIM. Он состоит из белков TIM 17,23,44 и некоторых др, еще не идентифицированных субъединиц. Для транспорта белков через внутреннюю мембрану нужно еще одно дополнительное условие: мембранный потенциал Δφ. Видимо, положительный заряд лидерной последовательности (пресиквенса) и отрицательным заряд со стороны матрикса на внутренней мембране способствуют прохождению пептида через транслокационную пору. Пептидная цепочка попадает в матрикс, где она вначале связывается с TIM44. После этого она связывается с шапероном мтБТШ70, что сопровождается гидролзом АТФ, и с др шаперонами. Проникновение пептидной цепочки через транслокационную пору происходит в результате теплового движения. Немедленное связывание с внутренним мтБТШ70 предотвращает обратный выход белка.

Когда полипептидная цепь полностью переходит в матрикс, N-концевая направляющая последовательность (пресиквенс) немедленно отрезается специальной пептидазой, осуществляющей процессинг белка. Сворачивание белков матрикса происходит с помощью супершаперонного комплекса БТШ60 и БТШ10.

Белки, предназначенные для наружной мембраны митохондрий, могут встраиваться в нее сразу после связывание с рецепторными субъединицами ТОМ-комплекса.

В большинстве случаев после транспорта через внешнюю мембрану белки, предназначенные для внутренней митохондриальной мембраны, встраиваются в нее сразу из межмембранного

пространства. Но в некоторых случаях белки могут содержать сигнальную последовательность, которая сначала направляет их в пространство матрикса. После удаления этого пресиквенса пептидазами такие белки встраиваются со стороны матрикса во внутреннюю мембрану с помощью второго сигнального пептида.

2. Особенности синтеза циклических пептидов. Современные возможности пептидного синтеза. Проблема рацемизации при синтезе.

Синтез циклопептидов Для получения циклических пептидов используются обычные для пептидного синтеза методы

создания амидной связи. Чаще всего первоначально создается линейный предшественник в виде защищенного пептида, активируется С-концевая карбоксильная группа, освобождается N-концевая аминогруппа и проводится реакция аминолиза собственной аминогруппой пептида. Для уменьшения межмолекулярных реакций аминолиза, приводящих к полимеризации и вследствие этого циклоолигомеризации, реакции циклизации проводят в условиях высокого разбавления в инертных растворителях.

Реакция циклоолигомеризации

Однако, как правило, побочные реакции полимеризации всегда имеют место и уменьшают выход циклического продукта. Лучшие результаты дает метод получения циклопептидов на полимерном носителе.

Выход циклических продуктов сильно зависит от стерических факторов: напряженности образующегося цикла, разветвленности боковых радикалов, термодинамических и конформационных параметров.

Рацемизация, т. е. полная или частичная потеря оптической чистоты одного или более аминокислотных остатков, является главной побочной реакцией в пептидном синтезе, накладывающей жесткие ограничения на выбор защитных групп и методов конденсации. Рацемизация приводит к образованию оптически неоднородных продуктов, разделение которых по мере удлинения цепи резко осложняется и превращается в практически неосуществимую задачу. Реакция рацемизации протекает по двум механизмам: 1) через образование 5(4Н)-оксазолонов (часто называемых азлактонами) или 2) через енолизацию:

В общем случае степень инверсии у α-углеродного атома (рацемизации) определяется природой заместителей X, R, Y, температурой и рН среды. Аминокислоты и их неактивированные производные заметно рацемизуются в сильнокислой или щелочной среде, особенно при нагревании. Активированные производные аминокислот более подвержены рацемизации как в процессе их получения, так и в ходе аминолиза. Особенно легко рацемизуются производные пептидов, что осложняет проведение конденсации фрагментов. Следует отметить, что уретановые N-защитные группировки аминокислот (в том числе наиболее популярные Z- и Вос-группы) обладают низкой склонностью к образованию оксазолонов. Поэтому ступенчатый синтез с использованием этих групп

— один из наиболее надежных путей избежать рацемизации при синтезе пептидов.

3. Пренилирование белков. Другие типы липопротеинов.

Пренилирование — присоединение остатков изопреноидов (фарнезила и геранилгеранила). Как написано у меня в тетради:

Пренилирование происходит в ЭПР, там образуются изопрены, они могут полимеризоваться: 4 изопрена – геранил-геранил, 3 изопрена – фарнезил, 2 изопрена – геранил.

Хвост геранила или фарнезила отвечает за встраивание в мембрану.

ипопротеины (липопротеиды) — класс сложных белков, простетическая группа которых представлена каким-либо липидом. Так, в составе липопротеинов могут быть свободные жирные кислоты, нейтральные жиры, фосфолипиды, холестериды.

Липопротеины представляют собой комплексы, состоящие из белков (аполипопротеинов) и липидов, связь между которыми осуществляется посредством гидрофобных и электростатических взаимодействий. Липопротеины подразделяют на свободные, или растворимые в воде (липопротеины плазмы крови, молока и др.), и нерастворимые, т. н. структурные (липопротеины мембран клетки, миелиновой оболочки нервных волокон, хлоропластов растений).

Среди свободных липопротеинов (они занимают ключевое положение в транспорте и метаболизме липидов) наиболее изучены липопротеины плазмы крови, которые классифицируют по их плотности. Чем выше содержание в них липидов, тем ниже плотность липопротеинов. Различают липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП, 30-80 нм), низкой плотности (ЛНП, 18-26 нм), промежуточной (средней) плотности ЛПП (ЛСП, 25-35 нм), высокой плотности (ЛВП, 8-11 нм) и хиломикроны (75-1200 нм). Каждая группа липопротеинов очень неоднородна по размерам частиц (наиболее крупные — хиломикроны) и содержанию в ней апо-липопротеинов. Все группы липопротеинов плазмы содержат полярные и неполярные липиды в разных соотношениях.

Транспорт холестерина от периферийных тканей к печени - ЛВП, транспорт холестерина, триацилглицеридов и фосфолипидов от печени к периферийным тканям – остальные, хиломикроны - транспорт холестерина и жирных кислот, поступающих с пищей, из кишечника в периферические ткани и печень.

Нековалентная связь в липопротеинах между белками и липидами имеет важное биологическое значение. Она обусловливает возможность свободного обмена липидов и модуляцию свойств липопротеинов в организме.

Липопротеины являются структурными элементами мембран клеток животных организмов и транспортными белками холестерина и других стероидов, фосфолипидов и др.

Билет №12 1. Неферментативные посттрансляционные модификации белков. ???

Гликирование, или неферментативное гликозилирование, — реакция Майяра, происходящая с участием белков организма. В процессе этой реакции между восстанавливающей (открытой) формой сахара крови или клетки (глюкоза, фруктоза и др.) и амино-группами белков (лизина или N- концевой амино-группы) образуется продукт Амадори, или фруктозамин, который в процессе дальнейших реакций и преобразований превращается в т.н. «поздние продукты гликирования».

Гликирование многих белков способно нарушать их функционирование и приводить к патологическим последствиям. Гликирование гемоглобина (HbA1c) широко используется как кумулятивный показатель содержания глюкозы в крови при диагностике диабета.

3.D и L формы аминокислот медленно превращаются друг в друга. Смесь таких кислот называется рацематом. Например, в белке дентина ( костная ткань зубов) L-аспарагиновая кислота самопроизвольно превращается в D со скоростью 0.1% в год.

4.Накопление в веществе хрусталика продуктов модификаций ароматических аминокислоттирозина и триптофанакинуренина. Является фотосенсибилизатором, это в свою очередь приводит

кусилению процессов перекисного окисления липидов хрусталика за счет постоянной генерации на свету активных форм кислорода.

2.Образование пептидной связи: методы смешанных ангидридов и активированных эфиров, карбодимидный и карбоксиангидридный методы конденсации.

Образование пептидной связи в общем сводится к отщеплению элементов воды. Для того чтобы сделать эту реакцию возможной и, более того, обеспечить ее высокую скорость и полноту, необходимо активировать карбоксильную группу. Такая активация должна сводиться к увеличению электрофильности карбонильного углерода (С6 + ).

Как легко видеть, важная роль в этом случае принадлежит группе X', которая в конечном счете определяет эффективность активации. Методы конденсации

обычно различаются природой группы.

1)Методы смешанных ангидридов аминокислот.

Хлорангидридный метод. Хлорангидридный метод, упоминавшийся в историческом очерке, в настоящее время применяется редко, так как сопровождается рацемизацией и образованием побочных продуктов. Хлорангидриды получаются обычно обработкой производных аминокислот и пептидов хлористым тионилом или пятихлористым фосфором.