Материал: 2_MIKROBIOLOGIYa_temy_5-9_FIZIOLOGIYa_I_IZMENChIVOST_MIKROORGANIZMOV

-водорастворимые (фенозиновые)

-спирторастворимые (пирроловые)

-нерастворимые (меланиновые)

Тема: Ферменты бактерий, их классификация. Методы выявления ферментативной активности микроорганизмов. Выделение чистых культур микроорганизмов (продолжение).

1. Классификации ферментов бактерий по биохимической активности, локализации, концентрации.

Все питательные вещества и элементы вступают в микробной клетке в реакции метаболизма при обязательном участии ферментов.

Ферменты – это специфичные, эффективные белковые катализаторы всех химических превращений, происходящих в клетке.

Ферменты бактерий классифицируют по ряду признаков

1)по биохимическому действию:

оксидоредуктазы;

гидролазы;

изомеразы;

трансферазы;

лиазы;

лигазы

2)по локализации относительно микробной клетки:

эндоферменты – локализуются внутри клетки (в ЦПМ, цитоплазме, периплазматическом пространстве);

экзоферменты – выделяются в окружающую среду: а) ферменты, осуществляющие «внешнее питание»;

б) ферменты патогенности (плазмокоагулаза, лецитиназа, коллагеназа и др.).

4

3)по концентрации:

1)конститутивные – постоянно синтезируются в определенных

концентрациях; 2) индуцибельные – находятся в клетке в следовых

концентрациях, но при наличии соответствующего субстрата в окружающей среде количество их резко возрастает.

Ферментный состав является стабильным признаком для каждого вида микроорганизмов, поэтому обнаружение ферментативной активности чистых культур микроорганизмов применяют при их идентификации.

Существуют группы ферментов, которые определяют при идентификации микроорганизмов в процессе бактериологического исследования:

сахаролитические (разлагают углеводы, многоатомные спирты);

протеолитические (разлагают белки, аминокислоты);

ферменты патогенности.

2. Методы определения ферментативной активности микроорганизмов

Существует несколько основных способов изучения ферментативной активности бактерий (рис.3)

5

Способы изучения ферментативной активности микроорганизмов

Автоматизированные методы с использованием приборов

Рис. 3. Основные способы определения ферментативной активности микроорганизмов

1.Посев чистой культуры на традиционные питательные среды дифференциально-диагностического ряда, содержащие питательную основу, субстрат и ииндикатор; принцип учета результатов основан на изменении цвета среды в ответ на изменение рН в результате разложения субстрата ферментами вырастающих бактерий.

2.Посев исследуемого материала, содержащего смесь бактерий, на коммерческие хромогенные агары, в которых содержатся дифференциально-диагностические и селективные компоненты. Вырастающие колонии различных родов или даже видов микроорганизмов приобретают характерные контрастные цвета. Характер окраски определяется взаимодействием родо- и видоспецифичных ферментов микроорганизмов с хромогенными субстратами. Например, на хромогенном агаре для обнаружения и подсчета уропатогенных бактерий, выделяемых из мочи,

Enterococcus faecalis формирует мелкие голубые колонии,

Pseudomonas aeruginosa - бесцветные, Staphylococcus aureus —

золотисто-желтые, Kelbsiella pneumoniae - сине-фиолетовые,

6

слизистые, Escherichia coli — розово-красные. Также разработаны хромогенные среды для выделения и дифференциации сальмонелл от энтеробактерий, различных видов стафилококков, дрожжеподобных грибов рода Candida и др. Неоспоримым преимуществом хромогенных агаров является сокращение сроков бактериологического исследования за счет совмещения этапов выделения и биохимической идентификации чистой культуры.

3.Внесение взвеси чистой культуры в пробирки с последующим помещением в них шаблонов-носителей - СИБов — систем индикаторных бумажных (диски или полоски хроматографической бумаги, покрытые защитной пленкой и содержащие определенный субстрат и индикатор).

4.Внесение взвеси чистой культуры в коммерческие микро-тест- системы (МТС) - полистироловые планшеты или панели, в лунках которых промышленным способом нанесены дегидратированные дифференциально-диагностическими среды. Мультитесты сгруппированы в планшетах «тематически» - для биохимической идентификации определенного семейства или рода бактерий. Примеры: ПБДЭ и ПБДС («Диагностические системы», Г.Н.Новгород), семейство систем API (BioMerieux, Франция), Enterotube П (Becton Dickinson, США) STRETO-тест и STAPHY-

ТЕСТ (Lachema, Чехия) и др. Они позволяют повысить точность результатов за счет стандартизации и увеличения количества тестов (от 15 до 30), снизить трудоемкость и время исследования.

5.Использование бактериологических анализаторов (рис.4) - полностью автоматизированных систем, исключающих участие сотрудников на этапах инкубации, учета и анализа результатов. Выпускаются баканализаторы BD Phоenix (Becton Dickinson,

США), VITEK и VITEK2 (bioMerieux, Франция), WalkAway

(Германия), Sensititre (Великобритания) и др. Принцип работы: взвесь чистой культуры микроорганизмов в определенной концентрации автоматически вносится в ячейки тест-системы, в которых находятся субстраты для биохимической идентификации. Панели тест-систем помещают в отсек прибора, предназначенный

7

для инкубации, на 4-6 ч. (экспресс-режим) или 24 ч. (обычный режим). Результат взаимодействия микроорганизмов с реактивами в каждой ячейке, имеющей штрих-код, фиксируется считывающим модулем прибора. Работа считывающего модуля может быть основана на спектрофотометрическом методе детекции (результаты учитываются в каждой лунке по изменению цвета в процессе жизнедеятельности бактерии), флюоресцентном учете, хроматографическом анализе жирных кислот микробной клетки и др. Прибор управляется компьютером, который вместе с монитором встроен в блок анализатора. После считывания результатов выполняется их компьютерный анализ с выдачей ответа, имеющего 99%-ю достоверность.

Рис. 4. Баканализатор BD Phоenix.

3. Выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов

8