Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

ВВЕДЕНИЕ. В природе чужеродная ДНК может попадать в клетки в нескольких процессах: 1) при переносе ДНК в виде плазмиды, вирусного или фагового генома (конъюгация, трансдукция, инфекция); 2) при передаче ДНК непосредственно в клетки (трансформация). Клетки, получившие чужеродный генетический материал, называются трансформированными. Методами генетической инженерии можно вводить гетерологичную ДНК в клетки.

ПЛАЗМИДЫ. Плазмиды встречаются в основном в бактериальных клетках. Они представляют собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, которая может встраиваться в хромосому клетки-хозяина или реплицироваться вне ее. В состав плазмиды входит сайт начала репликации, а также один или несколько важных для бактерии генов (например, гены устойчивости к антибиотикам). Плазмидную ДНК несложно отделить от ДНК хромосомы, а затем ее можно подвергнуть обработке ферментами. Таким образом получают векторы для клонирования и экспрессии чужеродных генов. Как правило, плазмидные векторы содержат несколько функционально важных элементов: 1) сайт начала репликации (ori), без которого невозможна репликация в клетке-хозяине; 2) иногда в плазмидный вектор встраивают дополнительный сайт начала репликации для размножения в других клетках-хозяевах (shuttle – челночный вектор); это позволяет проводить операции с генетическим материалом, используя чаще всего клет- ки-хозяева E. coli, а затем уже модифицированный вектор вводить в клетки исследуемого организма; 3) участок ДНК, содержащий уникальные сайты расщепления рестриктазами (MCS – multiple cloning sites); такой «полилинкерный» участок необходим для встраивания клонируемых фрагментов; 4) один или несколько селективных маркеров, позволяющих отличать клетки, несущие плазмиду, от нетрансформированных клеток (например, маркеры, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам или ауксотрофность). Чтобы облегчить поиск трансформированных клеток, в плазмидный вектор встраивают репортерный ген. При так называемом «бело-голубом» скрининге клонов после трансформации плазмидой pUC в качестве репортерного гена служит ген lacZ', так как в ней MCS фланкирован последовательностью гена α-пептида β-галактозидазы (lacZ'): в используемых клетках E. coli этот ген отсутствует в результате делеции, поэтому только трансформированные клетки способны синтезировать β-галактозидазу. Преимущество этого маркера заключается в том, что на агаре с 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозидом (X-Gal) трансформированные клетки образуют колонии характерного голубого цвета. Появление такой окраски

обусловлено наличием 5,5'-дибром-4,4'-дихлоринди- го – продукта расщепления X-Gal β-галактозидазой. В случае встраивания фрагмента в MCS колонии остаются белыми. Относительно небольшой размер плазмидых векторов (обычно не более 10 т.п.н.) облегчает процедуру выделения плазмиды, а также уменьшает вероятность негативной селекции при клеточном делении. Большинство плазмидных векторов разработаны для клеток E. coli, однако также имеется ряд плазмид для Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, лактобактерий и других важных для биотехнологии организмов. У эукариот плазмиды встречаются очень редко. В качестве примера можно привести 2 -плазмиду дрожжей Saccharomyces cerevisiae. На основе Ti-плазмиды почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens созданы векторы для трансформации двудольных растений.

БАКТЕРИОФАГИ И ВИРУСЫ. В природе передача генетического материала клетке-хозяину происходит при вирусной или фаговой инфекции. В лаборатории в качестве векторов используют ослабленные бактериофаги и вирусы, не способные к осуществлению лизиса и других патогенных действий из-за соответствующих модификаций генома. Практически для каждого рода бактерий описаны фаги, специфически инфицирующие только представителей данного рода. Многие из них широко используются в генетической инженерии, в том числе фаги λ и М13, поражающие клетки E. coli. Векторы на основе вирусных геномов часто применяют для трансформации животных и растительных клеток, а также при генной терапии человека и животных.

НЕБИОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ТРАНСФОРМАЦИИ сочетают в себе химические и физические методы. Выше мы уже рассказывали о трансформации клеток растений. Для трансформации животных клеток, лишенных клеточной стенки, или растительных протопластов* ДНК в виде кальциевой соли осаждают на поверхности клеток, и ее попадание внутрь клетки происходит в результате эндоцитоза. При электропорации под действием короткого электрического импульса в клеточной мембране временно образуются поры, достаточно большие для проникновения молекул ДНК в клетку. Липофекция – способ введения ДНК в клетки, при котором осуществляется слияние клетки с липосомой, содержащей ДНК. Для трансформации эукариотических клеток часто проводят микроинъекцию ДНК непосредственно в клеточное ядро. Как правило, для достижения высокой эффективности трансформации любой из указанных методов требует определенной оптимизации в соответствии с выбранным типом клеток и вектором.

ВВЕДЕНИЕ. Информацию о нуклеотидной последовательности гена, кодирующего тот или иной белок, можно получить, проводя анализ аминокислотной последовательности этого белка. Для клонирования генов с известной нуклеотидной последовательностью используют метод ПЦР. Для идентификации гена, кодирующего определенный белок, создается геномная библиотека, а затем проводится скрининг клеток, несущих нужную нуклеотидную последовательность, например по наличию в этих клетках специфической мРНК или по иммунологической реакции продукта.

КЛОНИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ПЦР.

Если имеется полная информация о нуклеотидной последовательности исследуемого гена или аминокислотной последовательности его продукта, можно выбрать последовательность синтетических праймеров, предназначенных для гибридизации с ДНК на концах гена. Обычно праймеры выбирают так, чтобы полученный после амплификации фрагмент ДНК содержал сайты рестрикции для последующего встраивания в экспрессирующий вектор.

КЛОНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК НЕИЗВЕСТНОГО СТРОЕНИЯ. Когда строение гена, кодирующего исследуемый белок, неизвестна, создают библиотеку генов организма. Для этого всю геномную ДНК разрезают на несколько фрагментов, встраивают их в векторы и проводят трансформацию. В качестве кле- ток-хозяев для создания геномной библиотеки можно использовать бактерии, культуры животных или растительных клеток. Маркерным геном для селекции трансформированных клеток может быть ген устойчивости к антибиотику. Способ отбора клонов, содержащих искомый ген, зависит от природы гена. Например, если ген может восполнять ауксотрофную мутацию в штамме-хозяине, клетки высевают на минимальную среду (лишенную вещества, необходимого для роста мутантного штамма), на которой выживают только те клетки, в которых содержится ДНК с исследуемым геном. Часто применяют систему из двух маркерных генов: один ген служит для отбора трансформированных клеток, а другой, содержащий в себе сайты для клонирования, – для отбора тех клеток, в которых вектор содержит вставку чужеродной ДНК. Встраивание фрагментов ДНК приводит к появлению нового фенотипа, т. е. к потере маркерного признака, например устойчивости к антибиотику. После предварительного отбора проводят дальнейший анализ клонов, несущих исследуемый ген.

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ И ГЕННЫХ ПРОДУКТОВ. Методы идентификации можно условно разделить на две группы: первые основаны на гибридизации ДНК со специфическими ДНКили РНКзондами, а вторые – на анализе белковых продуктов экспрессии гена. При поиске интересующего гена

часто проводят гибридизацию ДНК (в одноцепочечном состоянии) с ДНК-зондом, меченным радиоактивной или другой меткой (саузерн-блот). Другим методом обнаружения клонированного гена является гибридизация продукта транскрипции гена – мРНК – со специфическими ДНКили РНК-зондами (но- зерн-блот). Указанные методы применимы лишь в том случае, когда известна нуклеотидная последовательность гена, однако на практике часто возникает ситуация, когда структура клонированного гена неизвестна. В таком случае из ДНК-фрагментов геномной библиотеки выбирают те участки, экспрессия которых приводит к образованию исследуемого белка. Отбор клонов, в которых происходит синтез белка, проводят с помощью специфических антител (вес- терн-блот). Иммунная реакция с антителами, как правило, позволяет обнаружить не только полноразмерный белок, но и его фрагменты, что особенно важно, если в процессе создания библиотеки анализируемый ген был разделен на несколько фрагментов и оказался в двух или нескольких клонах. Описанный способ позволяет обнаружить гены, которые кодируют определенные белки. Для поиска в составе ДНК регуляторных элементов (промоторов и др.) используют векторы, несущие непосредственно за полилинкером, в который встраивается фрагмент, репортерный ген, например ген люциферазы. Клонированный промоторный участок можно обнаружить по наличию экспрессии репортерного гена.

ДРУГИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ. В последнее время для поиска гетерологичной ДНК с известной последовательностью часто применяют метод ПЦР с использованием праймеров, специфичных для данного гена. В случае, когда структура ДНК неизвестна, ее поиск осуществляют, сравнивая результаты рестриктного анализа ДНК из интактных и трансформированных клеток.