Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

мунной системой генома». В некоторых случаях РНК имеет вид рибозима (и следовательно обладает каталитической активностью) и способна к гидролизу фосфодиэфирных связей даже в отсутствие нуклеаз. В медицине разрабатывают рибозимы для клинической терапии вирусных инфекций (ВИЧ, гепатит B) и рака. Вероятно, во всех эукариотических клетках мРНК может быть разрушена посредством РНК-ин- терференции. В ходе этого процесса короткую двухцепочечную РНК (dsRNA) активирует РНКаза (DICER, т. е. «игрок в кости»), которая расщепляет dsRNA на небольшие фрагменты длиной 21–23 п.н. («руководящая» РНК). Затем в ходе так называемого эффекторного этапа они участвуют в АТФ-зависимой активации РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC), в который входят хеликаза, эндо- и экзонуклеаза, обеспечивающие специфичную активность. У целевых мРНК имеется последовательность, комплементарная «руководящим» РНК в составе RISCкомплекса, поэтому эти мРНК могут связываться с RISC и подвергаться деградации нуклеазами. Предполагается, что находящаяся в интронах ДНК участвует в управлении механизмом, играющим решающую роль при регуляции экспрессии, т. е. определяет, какие гены экспрессируются в том или ином типе клеток. К потенциальным областям применения малых интерферирующих РНК можно отнести и терапию вирусных заболеваний. Путем экспрессии специально синтезированной искусственной двухцепочечной РНК под промотором гена РНК-полимеразы III может быть предотвращена экспрессия специфичных вирусных генов в трансформированных клетках.

Методы генетической инженерии

Методы генетической инженерии

254

Геном прокариот

ВВЕДЕНИЕ. При создании генетических карт прокариот анализируют изменения фенотипических признаков, происходящие в результате процессов конъюгации (перенос ДНК из одной контактирующей клетки в другую), трансдукции (передача ДНК между двумя бактериальными клетками с помощью фага) или трансформации (введение очищенной ДНК в клетку). Первая физическая карта генома (полная нуклеотидная последовательность) была получена в 1995 г. Для построения карты генома используют метод выстраивания клонированных фрагментов в контиги и метод «дробовика» (shotgun).

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ. За изменением многих фенотипических признаков можно наблюдать при размножении бактерий. В качестве маркеров можно использовать способность бактерии образовывать жгутики или споры, а также устойчивость к антибиотику. Для изучения путей биосинтеза используют мутантные штаммы, в которых блокирована одна из стадий биосинтеза. Для роста таких мутантов необходимо наличие в среде веществ, которые бактерия сама больше не может синтезировать. Немаловажным преимуществом бактерий является короткий жизненный цикл (время между образованием клетки и ее делением), часто он занимает менее 1 ч. Сопоставление фенотипических изменений и времени проникновения тех или иных участков ДНК в клетку-реципиент при конъюгации позволяет определить взаиморасположение генов, которые кодируют эти признаки. Таким образом, карты генома прокариот строят в масштабе минут или центисом. Процесс переноса всего генома E. coli в клетку-реципиент при 37 °С занимает 100 мин.

ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ: ПОЛУЧЕНИЕ КОНТИГОВ. Важной задачей является идентификация клонов геномной библиотеки, содержащих перекрывающиеся фрагменты ДНК (контиги) (от англ. contiguous – непрерывный). Исходя из этой информации, можно реконструировать непрерывный ряд клонированных фрагментов, составляющих весь геном. Для поиска контигов применяют метод генетической «дактилоскопии» (clone fingerprinting), например, сравнивая рестриктные карты или перекрывающиеся STS и выявляя «соседние» клоны. Полезную информацию можно получать из анализа распределения генетических маркеров. Позиционное клонирование (т. е. поиск гена, соседствующего с маркером) осуществляют методом «прогулки по хромосоме» (chromosome walking). Уникальный участок ДНК, примыкающий к одному из концов клонированного фрагмента, используют в качестве зонда для гибридизации с геномной библиотекой. Некоторые гибридизующиеся клоны полностью перекрываются с исходным участком, а другие включают новые сег-

менты. Таким образом карта расширяется. При повторении этой процедуры совершается «прогулка» на бо’ льшее расстояние.

ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОМА: МЕТОД «ДРОБОВИКА» (SHOTGUN). Физическая карта генома представляет собой его полную нуклеотидную последовательность. В настоящее время возможно секвенирование фрагментов ДНК размером до 600 п.н. Для создания физической карты геном разрезают на небольшие фрагменты с помощью рестриктаз или ультразвука, затем секвенируют клонированные фрагменты и с помощью компьютерных программ устанавливают последовательность их расположения в геноме. Современные компьютерные технологии позволяют быстро составлять карты и анализировать бактериальные геномы (размером, как правило, до 5 млн п.н.). Наличие генетических карт и постоянное пополнение данных о взаиморасположении генетических маркеров позволяет проводить корреляцию между физической и генетической картами. Так, к 1990 г. на хромосоме E. coli были локализованы более 1400 генетических маркеров, расположенных

всреднем через каждые 3300 п.н. (размер всего генома E. coli составляет 4,64 млн п.н.). БИОИНФОРМАТИКА. Большинство компьютерных программ для анализа генома основываются на поиске гомологичных последовательностей, поэтому даже такое редкое явление, как ошибка секвенирования (стандартная точность секвенирования составляет 99%), приводит к появлению неточностей практически во всех последовательностях. По этой причине

вкомпьютерные банки данных вносят информацию, подтвержденную многократным секвенированием.