Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Методы генетической инженерии

246

Экспрессия генов

ВВЕДЕНИЕ. Основной целью большинства биотехнологических исследований является экспрессия генов или целых оперонов (нескольких генов, транскрибируемых с образованием одной молекулы мРНК). Для экспрессии в клетки вводят вектор. В зависимости от выбора клеток-хозяев вектор может реплицироваться вне хромосомы (например, у бактериальных клеток, в том числе E. coli) или встраиваться в хромосому хозяина (практически во всех эукариотических системах). Наличие индуцибельного промотора для клонированного гена позволяет «включать» и «выключать» экспрессию гена путем изменения условий. В случае высших организмов (растений и животных) к гену часто добавляют последовательности ДНК, кодирующие специфические сигнальные последовательности аминокислот. Такие последовательности обеспечивают транспорт генного продукта в определенные клеточные компартменты или направляют его по пути экзоцитоза.

ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ. Вектор, предназначенный для экспрессии в прокариотических клетках, например в E. coli, кроме клонированного структурного гена или оперона содержит сайт начала репликации и ген устойчивости к антибиотику. Экспрессия, т. е. образование, гена является результатом действия целого ряда регуляторных факторов и соответствующих белков – ферментов и факторов транскрипции и трансляции. В клетке E. coli фермент РНК-полимераза, осуществляющая транскрипцию, связывается с регуляторным участком–про- мотором, для которого характерно наличие определенных консервативных последовательностей в области –35 и –10 нуклеотидов до сайта инициации транскрипции, и начинает транскрипцию гена. Транскрипция заканчивается, когда РНК-полимераза достигает участка ДНК, где расположен терминатор транскрипции, обеспечивающий во многих случаях образование шпильки в синтезируемой мРНК. Для эффективной экспрессии обычно выбирают индуцибельные промоторы. Так, промотор лактозного оперона E. coli активируется (индуцируется) при добавлении в среду индуктора – изопропилтио-β-D-галактозида (IPTG). Индуктор взаимодействует с белком – репрессором лактозного оперона – и предотвращает его связывание с ДНК, при этом освобождается место для РНК-полимеразы, и транскрипция возобновляется. В настоящее время разработано много векторов для экспрессии. Все они содержат так называемые полилинкерные участки, в которых находятся уникальные сайты рестрикции, удобные для встраивания генов.

ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ имеют такую же структуру, как и векторы для экспрессии в прокариотах, и содержат следующие функциональные элементы: генетический маркер,

обеспечивающий селекцию трансформированных клеток, индуцируемый эукариотический промотор с консенсусными последовательностями (TATA-, CCAAT- и GC-боксами), сайт инициации транскрипции (стартовый кодон ATG), сайт терминации транскрипции, сигнал полиаденилирования мРНК и полилинкер для встраивания генов. Полученные генные продукты могут направляться в различные клеточные компартменты благодаря наличию специфических сигнальных последовательностей. Векторы для экспрессии в эукариотических клетках редко реплицируются автономно: как правило, они встраиваются в хромосому хозяина в результате рекомбинации. Чтобы осуществлять отбор трансформированных клеток млекопитающих, в вектор встраивают селективные маркерные гены, например ген дигидрофолатредуктазы или неомицинфосфотрансферазы. В среду роста клеток после трансфекции добавляют токсичные соединения метотрексат или неомицин. Нетрансформированные клетки не могут расти в присутствии этих соединений, а клетки, несущие вектор, и, следовательно, способные инактивировать токсины, выживают. Для отбора клеток с бо’ льшим числом копий вектора увеличивают концентрацию токсинов в среде.

ПРОМОТОРЫ. В зависимости от уровня экспрессии гена (т. е. количества образующегося белкового продукта) различают сильные и слабые промоторы. Для многих естественных промоторов описано явление «подтекания» – наличие невысокого уровня экспрессии даже в присутствии репрессора. В генно-инже- нерных экспериментах обычно выбирают «неподтекающий» индуцибельный промотор необходимой силы, что позволяет, изменяя условия роста клеток, полностью подавлять или включать экспрессию гена. Типичными для экспрессии в клетках E. coli являются lac-, trp- и tac-промоторы, которые можно индуцировать добавлением специфических реагентов в среду роста бактерии. Экспрессия генов, встроенных под промотор λPL, индуцируется при повышении температуры от 30 до 42 °С. Для клонирования и экспрессии генов в грибах используют галактозный промотор GAL10 (Saccharomyces cerevisiae), промотор алкогольоксидазы AOX (Pichia pastoris) или промотор глюкоамилазы (Aspergillus). Промотор металлотионеина часто выбирают для экспрессии генов в животных клетках. При работе с трансгенными растениями и животными удобно использовать промотор, который регулируется процессами, протекающими в орга- низме-хозяине. Например, в экспериментах с трансгенными животными исследуемый ген часто встраивают под сильный промотор, специфический для молочных желез. Индукция экспрессии гена происходит при лактации, и таким образом удается получать достаточно большие количества рекомбинантного белка непосредственно из молока.

ной терапии. Действительно, в экспериментах с животными было показано, что развитие опухоли головной мозга (глиомы) прекращается, если клетки трансформировать с антисмысловой кДНК инсулиноподобного фактора роста 1. Клетки опухоли синтезируют этот гормон в избыточном количестве, и прекращение синтеза приводит к подавлению патологического процесса. В этих экспериментах использовали эписомальный экспрессирующий вектор, в котором ген в обратной ориентации находился под контролем металлотионеинового промотора. Беспокойство у экологов вызывает также вероятность горизонтального распространения устойчивости к антибиотикам в результате генетических манипуляций. Совершенно новая концепция применения асРНК предполагает введение асРНК путем инъекции. В организме РНК быстро деградирует под действием рибонуклеаз, поэтому особый интерес вызывают устойчивые соединения – аналоги РНК (например, фосфотионаты). Многие препараты, содержащие асРНК, сейчас находятся на стадии клинических испытаний, в том числе препарат для орального применения против хронического энтерита и различные противовирусные препараты. Недавно было показано, что в этих явлениях играют определенную роль фрагменты ДНК, связанные с РНК-интерференцией и малыми интерферирующими РНК. Другим примером успешного применения антисмысловой РНК является создание томатов сорта FlavrSavrТМ, которые хранятся в течение длительного времени. Показано, что размягчение плодов при хранении обусловлено активацией генов, кодирующих фермент полигалактоуронидазу. Экспрессирующий вектор на основе Тi-плазмиды сконструировали таким образом, что участок гена, кодирующего этот фермент, был встроен в обратной ориентации и оказался под контролем промотора вируса табачной мозаики. Полученный вектор ввели в клетки растения, а затем по результатам саузерн- и нозерн-блоттинга сделали вывод о том, что вектор интегрировался в геном. В трансформированных растениях интенсивность синтеза полигалактоуронидазы была значительно снижена, и плоды сохранялись длительное время в обычных условиях. Аналогичная стратегия эксперимента позволяет получать растения, устойчивые к вирусным инфекциям. Для этого используют асРНК, комплементарную РНК белка капсида вируса. В качестве генетического маркера трансгенные растения несут ген устойчивости к антибиотику. Противники трансгенных организмов предупреждают об опасности возникновения аллергических реакций на новые генные продукты при употреблении трансгенных организмов в пищу, а также распространения гена устойчивости к антибиотику в природных системах путем горизонтального переноса.