Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

инженерии

ПЦР: лабораторная практика

ВВЕДЕНИЕ. Метод ПЦР позволяет применить ампли-

фикацию ДНК при решении многих молекулярно-гене-

генетической

тических задач. В этом разделе мы рассмотрим сле-

дующие примеры применения ПЦР в лабораторной

практике: 1) введение в ДНК функциональных элемен-

тов; 2) амплификация РНК (ОТ-ПЦР); 3) соединение

двух фрагментов ДНК; 4) встраивание новых участков

в последовательность ДНК; 5) удаление фрагментов

ДНК из гена; 6) осуществление сайт-направленного

Методы

мутагенеза.

ВВЕДЕНИЕ В ДНК ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ.

Примеры функциональных элементов: сайты узнава-

ния рестриктаз, обеспечивающие более простое кло-

нирование генов, стопили старт-кодоны, позволяю-

щие

экспрессировать определенные фрагменты

белка.К функциональным элементам относятся, кро-

ме того, так называемые tag-последовательности: в

результате их трансляции на N- или C-конце белка

образуется надстройка из нескольких остатков гисти-

дина. Наличие такой последовательности позволяет

быстро выделять белок методом металло-аффинной

хроматографии.

КОПИРОВАНИЕ И АМПЛИФИКАЦИЯ мРНК (ОТ-ПЦР).

Амплификация мРНК методом ПЦР возможна в том

случае, если известна последовательность хотя бы

одного ее конца (такую информацию можно полу-

чить, например, определив концевую аминокислот-

ную последовательность исследуемого белка). Сна-

чала

синтезируют

праймер,

комплементарный

известному концу мРНК, а затем проводят гибриди-

зацию с выделенной клеточной мРНК. В образовав-

шемся дуплексе праймер служит в качестве затравки

для достраивания кДНК ферментом обратной транс-

криптазой. Полученную кДНК можно далее амплифи-

цировать методом ПЦР.

СОЕДИНЕНИЕ ДВУХ ФРАГМЕНТОВ ДНК. В первых двух

циклах ПЦР происходит независимая амплификация

двух фрагментов, которые необходимо объединить.

При этом праймеры подбирают таким образом, чтобы

образовавшиеся продукты ПЦР содержали идентичные

последовательности на участках их слияния. В третьем

цикле ПЦР полученные комплементарные участки

продуктов гибридизуются, сами продукты служат в ка-

честве матриц, а в реакционную среду добавляют кон-

цевые (терминальные) праймеры. Так происходит ам-

плификация продукта слияния двух фрагментов. При

таком способе соединения ДНК необходимо следить

за сохранением рамки считывания триплетов. Между

двумя генами вводят так называемый спейсер, коди-

рующий короткую аминокислотную последователь-

ность (чаще всего это поли-L-аланин), обеспечиваю-

щий

необходимую

подвижность

экспрессируемых

236

белков относительно друг друга (например, в случае

синтеза антител).

ВВЕДЕНИЕ. Синтез олигонуклеотидов – коротких

лугам специализированных химических фирм, кото-

одноцепочечных фрагментов ДНК размером до

рые гарантируют быстрый, недорогой и точный син-

100 остатков – доступен практически в любой совре-

тез олигонуклеотидов.

менной химической лаборатории. Олигонуклеотиды

УСТАНОВЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ ДНК. Молекулы ДНК

получили широкое распространение при молекулярно-

несут отрицательный заряд, поэтому их можно раз-

биологических исследованиях, например, в качестве

делять методом электрофореза в геле. Гель, приго-

затравки (праймера) для ПЦР. Для определения моле-

товленный из агарозы или полиакриламида или их

кулярных размеров фрагментов ДНК до 30 т.п.н.

смеси, обладает пористой структурой (агарозные

используют гель-электрофорез, в ходе которого под-

гели имеют крупные поры, а полиакриламидные –

вижность исследуемого фрагмента сравнивается с

мелкие), поэтому при движении под действием элек-

подвижностью фрагментов известного размера.

трического тока фрагменты ДНК в геле разделяются

ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ДНК. В настоящее время наи-

в соответствии с размерами молекул. Сравнивая

более распространен фосфорамидитный синтез

подвижность исследуемой ДНК с подвижностью

олигонуклеотидов. Этот метод позволил автоматизи-

ДНК-маркеров известного размера, можно опреде-

ровать процесс синтеза. Исходными соединениями

лить размер фрагмента ДНК до 30 т. п. н. Для визу-

являются модифицированные дезоксирибонуклеоти-

ального наблюдения за молекулами ДНК используют

ды, у которых 3'-фосфитная группа несет диизопро-

бромистый этидий (EtBr) или радиоактивную метку с

пиламиногруппу, которая в свою очередь защищена

последующей авторадиографией. Бромистый эти-

метильным остатком, а 5'-гидроксильная группа ос-

дий – сильный канцероген, поэтому при работе с ним

татка дезоксирибозы и аминогруппы пуриновых и пи-

необходимо строгое соблюдение правил техники без-

римидиновых оснований также блокированы. Такая

опасности. Чувствительность метода с использова-

защита нуклеозидов предотвращает нежелательные

нием бромистого этидия составляет около 25 нг (на-

реакции в ходе синтеза олигонуклеотида. Первый ну-

нограммов) ДНК. Радиоактивное мечение молекул

клеозидный компонент, в котором 5'-гидроксильная

ДНК с помощью 32Р позволяет повысить чувстви-

группа защищена диметокситритильной группой, фи-

тельность метода, однако такие исследования можно

ксируют на инертном твердом носителе. При снятии

проводить только в специально оборудованных

защиты с 5'-гидроксила к нему присоединяется сле-

изотопных блоках. В последнее время получили рас-

дующий нуклеозид в виде фосфорамидита, активи-

пространение методы наблюдения за ДНК с исполь-

рованного тетразолом. Образовавшаяся триэфирная

зованием флуоресцентных красителей. Чувстви-

связь нестабильна, поэтому эфир окисляют в присут-

тельность такого метода, например, с применением

ствии иода до пятивалентного фосфотриэфира. Та-

SYBR-Green в 25–100 раз превышает чувствитель-

кой цикл синтеза ДНК, который в отличие от природ-

ность метода с использованием EtBr, что позволяет

ного процесса происходит в направлении 3' → 5'

определять ДНК в количестве всего 250 пг (пико-

повторяется, пока не будет получен олигонуклеотид с

граммов). После возбуждения флуоресценции в

искомой последовательностью. Затем все защитные

маркерных группах детекцию проводят в фосфои-

группы удаляют, а однонитевой олигонуклеотид очи-

миджере. Определение ДНК является необходимой

щают методом гель-электрофореза или ВЭЖХ. Даже

процедурой во многих молекулярно-билогических

если продуктивность каждого цикла составляет 98%,

экспериментах, например при проведении рестрикт-

при синтезе 20-звенного олигонуклеотида только

ного анализа ДНК или при ПЦР-клонировании генов

67% полученных олигонуклеотидов будут иметь нуж-

и их фрагментов из хромосомной, вирусной или

ную длину, а при синтезе 40-звенного фрагмента вы-

плазмидной ДНК.

ход составит лишь 45%. Для синтеза более длинных

олигонуклеотидов или целых генов, как правило, ис-

пользуют метод ПЦР. Химически синтезированные

олигонуклеотиды широко применяются в молекуляр-

но-биологических экспериментах: 1) для синтеза

фрагментов генов или целых генов небольшого раз-

мера; 2) в качестве зонда или праймера для иденти-

фикации генов или их фрагментов в генной библио-

теке или библиотеке кДНК методами гибридизации

или ПЦР; 3) для сайт-направленного мутагенеза;

4) для секвенирования ДНК. Если в лабораторной ра-

боте необходимы фрагменты ДНК, значительно пре-

вышающие 100 п.н., как правило, обращаются к ус-