Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

ВВЕДЕНИЕ. Для модификации ДНК in vitro обычно используют следующие ферменты: 1) гидролазы– специфически расщепляют ДНК; 2) лиазы – соединяют фрагменты ДНК; 3) синтетазы – достраивают недостающую цепь ДНК на одноцепочечной матрице; 4) модифицирующие ферменты – действуют на 3'- или 5'-концы ДНК.

ГИДРОЛАЗЫ. Наиболее важными гидролазами являются описанные выше эндонуклеазы рестрикции. В настоящее время доступны многие рестриктазы, действующие на различные сайты узнавания, а также различающиеся по свойствам, образуя после рестрикции или «тупые», или «липкие» (с коротким одноцепочным фрагментом) концы. Другой часто используемый представитель гидролаз – нуклеаза S1, выделяемая из гриба Aspergillus oryzae. Этот фермент расщепляет одноцепочечную ДНК, в том числе и одноцепочечные участки (бреши) в двухцепочечной ДНК.

ЛИАЗЫ И ТРАНСФЕРАЗЫ. Чаще всего используется ДНК-лигаза. Этот фермент относится к системе репарации клетки и служит для сшивания разрывов в одноили двухцепоченых молекулах ДНК. Такие разрывы могут образовываться как в результате случайного повреждения клеточной ДНК, так и в ходе репликации и рекомбинации, поэтому ДНК-лигаза присутствует во всех клетках. В генетической инженерии лигазу используют для создания рекомбинантных молекул ДНК (например, при встраивании фрагмента ДНК в вектор). ДНК-лигаза может сшивать фрагменты как с «липкими», так и с «тупыми» концами, однако лигирование «липких» концов происходит значительно более эффективно, так как между комплементарными участками образуются нековалентные связи. По этой причине перед лигированием «тупые» концы, как правило, превращают в «липкие», используя для этого линкер, адаптор или наращивая концевые гомополимерные последовательности с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (tailing). ДНК-лигазу (Т4-ДНК-лигазу) получают из клеток Escherichia coli, инфицированных бактериофагом Т4 , а терминальную трансферазу – из клеток тимуса теленка.

СИНТЕТАЗЫ. Из этих ферментов чаще используется ДНК-полимераза I и обратная транскриптаза. В ходе репликации в клетке E. coli ДНК-полимераза I в присутствии праймера взаимодействует с одноцепочечной ДНК и синтезирует комплементарную нить ДНК в направлении 5' → 3'. Этот фермент также обладает 3' → 5'- и 5' → 3'-экзонуклеазными активностями. ДНК-полимераза I узнает короткие одноцепочечные участки в двухцепочечной молекуле ДНК и использует их в качестве матрицы для достраивания. Если удалить концевой фрагмент полипептида размером в 323 аминокислоты, 5' → 3'-нуклеазная акти-

вость ДНК-полимеразы I теряется. Оставшийся фермент, называемый фрагментом Клёнова, обладает полимеразной и 3' → 5'-нуклеазной активностями и может достраивать одноцепочечные «бреши» в двунитевой молекуле ДНК. Обе формы фермента (холофермент и фрагмент Клёнова) используются при проведении радиоактивного мечения ДНК. При проявлении радиоавтограммы те области рентгеновской пленки, которые соприкасались с меченой ДНК, становятся черными. Самым распространенным способом мечения ДНК является достраивание 5'-выступа- ющих концов ДНК с помощью фрагмента Клёнова в присутствии 32Р-меченых нуклеотидов. ДНК-полиме- разы термофильных микроорганизмов используют для ПЦР. Обратная транскриптаза – очень важный фермент, обнаруженный у ретровирусов. В качестве матрицы обратная транскриптаза использует РНК и синтезирует на ней комплементарную цепь ДНК. Это свойство используют для получения кДНК-копий матричной РНК. Обратную транскриптазу получают из животных клеток, зараженных ретровирусами: вирусом миобластомы птиц (AMV) или вирусом лейкоза Молони мыши (MMLV).

ФЕРМЕНТЫ, МОДИФИЦИРУЮЩИЕ КОНЦЕВЫЕ ГРУППЫ.

В экспериментах по клонированию часто возникает необходимость ввести или, наоборот, удалить 5'-концевую фосфатную группу. Для осуществления таких реакций существует множество трансфераз и гидролаз.

ВВЕДЕНИЕ. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является в настоящее время одним из наиболее широко используемых генетической инженерии. За разработку этого метода Кэри Маллису была присуждена Нобелевская премия. В ходе ПЦР происходит многократное увеличение числа копий специфических фрагментов ДНК. Другими словами, ПЦР позволяет селективно амплифицировать выбранный фрагмент ДНК. Особенно важным применением ПЦР является поиск фрагментов ДНК с определенной последовательностью среди множества фрагментов, полученных в результате генно-инженерных манипуляций.

ПРИНЦИП МЕТОДА. Для стандартного проведения ПЦР необходимы два олигонуклеотидных праймера, которые комплементарны 3'-концам участков, ограничивающих выбранный для амплификации фрагмент ДНК. Необходимую для синтеза таких олигонуклеотидов информацию получают либо из результатов секвенирования ДНК, либо путем перевода последовательности аминокислот в последовательность триплетов нуклеотидов (с учетом вырожденности генетического кода). Кроме ДНК-матрицы и праймеров для проведения ПЦР необходима смесь четырех типов дезоксинуклеозидтрифосфатов и фермент Т7-ДНК-по- лимераза. ПЦР осуществляется в три стадии. 1. При 94 °С цепи ДНК расходятся (ДНК денатурирует). 2. При понижении температуры до 40–60 °С праймеры присоединяются к комплементарным им участкам ДНК-матрицы (отжиг праймеров). 3. При повышении температуры до 72 °С происходит синтез новых цепей ДНК (достраивание праймеров). При последующем повышении температуры до 94 °С новосинтезированные и матричные цепи ДНК снова расходятся, и при охлаждении каждый фрагмент служит новой матрицей для синтеза. В автоматическом режиме каждый такой цикл повторяется 25–40 раз (в зависимости от матрицы один цикл занимает от нескольких секунд до нескольких минут), и за несколько часов количество исходной ДНК достигает 225–40 копий. Повторение циклов ПЦР возможно только в том случае, если используемая ДНК-полимераза сохраняет стабильность при повышенных температурах. Поэтому ферменты для ПЦР получают из клеток термофильных бактерий:

Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus и Thermotoga maritima (Taq-, Pfu- и Tma-полимеразы соответственно). Вероятность ошибочного включения нуклеотида (частота мутаций на пару нуклеотидов за цикл удвоения) у Taq-полимеразы составляет примерно 8 10–6. Другие названные полимеразы осуществляют более точный синтез ДНК, так как в отличие от Taq-полиме-

разы проводят дополнительный контроль правильности синтеза. Молекулярную массу и количество продукта ПЦР определяют методом гель-электрофореза или непосредственно в ходе реакции по увеличению количества метки (на приборе Light-cycler).

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ. С помощью ПЦР можно быстро клонировать и секвенировать выбранные фрагменты ДНК. Как было показано при амплификации фрагмента ДНК, выделенной из одного сперматозоида, метод позволяет работать с единичными молекулами ДНК. Поэтому ПЦР успешно применяется в судебной медицине, археологии и палеонтологии. В клинической диагностике метод ПЦР также находит широкое применение: в настоящее время для многих инфекционных болезней, а также большого числа наследственных патологий уже выявлена связь между последовательностью нуклеотидов в ДНК и наблюдаемой клинической картиной. Обнаружение материала трансгенных растений и выявление возбудителей инфекционных заболеваний – примеры использования ПЦР в анализе пищевых продуктов и экологическом мониторинге. Если известна консервативная последовательность аминокислот, характерная для определенного семейства белков, то, используя соответствующие праймеры, можно осуществлять поиск новых членов этого семейства (обратная генетика). ПЦР можно применять для внесения в ген мутаций: для этого используют праймер, не полностью комплементарный матрице, или искусственно увеличивают вероятность ошибочного включения нуклеотидов в ходе реакции. Матрицей в ПЦР может служить не только ДНК, но и РНК: обратная транскриптаза синтезирует копию РНК – кДНК, которая амплифицируется по стандартной схеме. Этот метод называется ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) и часто применяется при определении количественного соотношения между различными мРНК, а также для обнаружения РНК-содержащих вирусов, например вируса ВИЧ. Техника для проведения ПЦР успешно миниатюризируется: в микросистемах («lab-on-a-chip») возможно увеличить количество образца ДНК в 220 раз менее, чем за час.