Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

От хромосомы к двойной спирали

250 нм

10 нм

2 нм

Короткое плечо (p)

Центромера

Длинное плечо (q)

нм

30

Гистон

Хроматиновая фибрилла,

Двойная

Целая метафазная хромосома

содержащая 1200 п.н.

спираль ДНК –

Петли хроматина – около 100 000 п.н. на петлю

«Бусины» нуклеосом – по 80 п.н.

10 п.н. в 3,4 нм

Структура ДНК

Аминокислота

Аминокислота

Кодон

Фенилаланин (F)

Серин (S)

Тирозин (Y)

Цистеин (C)

UGU

UGC

Лейцин (L)

Стоп-кодон

Стоп-кодон

UGA

Стоп-кодон

Триптофан (W)

UGG

Лейцин (L)

Пролин (P)

Гистидин (H)

Аргинин (R)

CGU

CGC

Глутамин (Q)

CGA

CGG

Изолейцин (I)

Треонин (T)

Аспарагин (N)

Серин (S)

AGU

AGC

Лизин (K)

Аргинин (R)

AGA

Метионин (M)

AGG

Валин (V)

Аланин (A)

Глицин (G)

GGU

GGC

GGA

GGG

инженерии

Эксперимент в генетической инженерии

ВВЕДЕНИЕ. В генно-инженерных исследованиях при-

меняют обратные транскриптазы с различными свой-

меняются очень многие методы. К наиболее часто

ствами. Чаще всего используют ДНК-полимеразу,

генетической

используемым относятся следующие: 1) выделение

выделенную из Thermus aquaticus. Этот фермент, ус-

ДНК, ее амплификация, различные модификации с

тойчивый при высокой температуре, в присутствии

помощью ферментов, установление нуклеотидной

Mn2+ действует как обратная транскриптаза, достра-

последовательности ДНК, осуществление химиче-

ивая цепь ДНК на РНК-матрице. После завершения

ского синтеза ДНК определенной последовательно-

реакции полученный гибридный дуплекс мРНК–ДНК

сти; 2) клонирование и экспрессия генов в эукариоти-

обрабатывают ферментом РНКазой и получают одно-

ческих и прокариотических клетках.

цепочечную ДНК, которую можно использовать в ка-

Методы

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК, ЕЕ АМПЛИФИКАЦИЯ И ОБРАБОТКА

честве матрицы для создания двухцепочечной ДНК в

МОДИФИЦИРУЮЩИМИ ФЕРМЕНТАМИ. Количество

обычной ПЦР. Для неспецифической амплификации

ДНК в клетке очень мало’ (одна молекула ДНК на

эукариотических мРНК используют участок полиаде-

прокариотическую клетку и один или два набора хро-

нилирования на 5'-конце мРНК: в качестве затравки

мосом на эукариотическую клетку), тем не менее

для синтеза кДНК на матрице мРНК служит олиго-

ДНК из клеток можно выделить химическими мето-

мер, состоящий из тимидиновых оснований (polyT).

дами, выполнить ее анализа и использовать в даль-

ЭКСПРЕССИЯ. К настоящему времени разработано

нейших исследованиях. Как правило, для работы не

несколько методов встраивания ДНК в ДНК другого

применяют длинные цепи ДНК, а обрабатывают ее

хозяина. После репликации в процессе клеточного

специальными ферментами, которые могут расщеп-

деления происходит транскрипция ДНК, а затем в ре-

лять ДНК по определенным сайтам, осуществлять ее

зультате трансляции образуются белки, среди кото-

модификации, соединять фрагменты ДНК, а также

рых и белок, закодированный в клонированном фраг-

переводить ДНК в мРНК. Большинство эксперимен-

менте ДНК. Совокупность этих процессов называется

тов требует достаточно больших количеств ДНК: с

экспрессией клонированного гена. В качестве кле-

помощью автоматических синтезаторов можно полу-

ток-хозяев, как правило, используют бактериальные

чить лишь небольшие фрагменты ДНК, размером до

клетки. Такой выбор обусловлен следующими

100 п.н., поэтому особое значение приобретает ме-

особенностями бактерий: 1) их геном представлен

тод ПЦР, позволяющий амплифицировать фрагмен-

всего лишь одной двухцепочечной молекулой ДНК;

ты ДНК размером в тысячи пар нуклеотидов. Важное

2) для переноса генетического материала можно

применение метода ПЦР – рекомбинация между

использовать фаги или плазмиды; 3) молекулярно-

фрагментами ДНК из различных источников, напри-

генетические основы организации многих бактерий

мер между ДНК, выделенной из живого организма, и

достаточно хорошо изучены; 4) бактерии быстро раз-

химически синтезированной ДНК.

множаются, и в биореакторах можно выращивать

СВОЙСТВА ДНК И СЕКВЕНИРОВАНИЕ. Основные

очень большие количества бактериальных клеток.

характеристики ДНК: 1) температура плавления (ДНК

Наряду с Escherichia coli для клонирования и экспрес-

с бо’ льшим содержанием пар GC денатурирует при бо-

сии чужеродной ДНК используют и другие бактерии,

лее высокой температуре по сравнению с ДНК, обога-

например Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas и

щенной парами АТ); 2) молекулярная масса (этот па-

Streptomyces. В последнее время разработаны мето-

раметр устанавливают путем электрофоретического

ды введения ДНК и в эукариотические организмы,

разделения фрагментов ДНК в присутствии фрагмен-

такие как дрожжи, грибы, а также в клетки растений

тов ДНК известного размера); 3) последовательность

и животных.

нуклеотидов, которую устанавливают путем секвени-

рования ДНК; 4) белковый продукт или функциональ-

ный элемент, закодированный в исследуемой ДНК;

5) взаиморасположение сайтов расщепления эндону-

клеазами рестрикции (карта рестрикции).

КЛОНИРОВАНИЕ. Методы, позволяющие выделить из

генома прокариот участок, кодирующий определен-

ный белок, также применимы и для эукариот, однако

в этом случае необходимо учитывать наличие интро-

нов в большинстве эукариотических ДНК. Зрелую

(после сплайсинга) мРНК выделяют из клетки, а за-

тем с помощью фермента обратной транскриптазы

228

(ОТ) в реакции ОT-ПЦР синтезируют комплементар-

ную цепь ДНК (кДНК). В лабораторной практике при-