Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

методов

Очистка биотехнологических продуктов

ВВЕДЕНИЕ. Образовавшийся в процессе фермента-

рушения клеток тельца включения отделяют центри-

биотехнологических

ции продукт может накапливаться внутри клетки

фугированием. В результате обработки телец вклю-

(если продукт является внутриклеточным ферментом

чения тиолами и мочевиной белок переводится в

или белком в составе телец включения) или выхо-

растворимое состояние, причем современные мето-

дить в культуральную среду. В традиционно применя-

дики позволяют сделать этот процесс обратимым.

емых для ферментации штаммах концентрация про-

При удалении мочевины диализом возможна ренату-

дукта обычно небольшая и составляет менее 10%, а

рация белка с образованием правильной системы ди-

часто даже менее 1% клеточного содержимого.

сульфидных связей. Дальнейшие этапы очистки вну-

Методы генетической инженерии позволяют значи-

триклеточных ферментов и ренатурированных из

тельно повышать выход продукта: в некоторых

телец включения белков аналогичны соответствую-

случаях этот показатель достигает 50%. После за-

щим этапам очистки внеклеточных продуктов.

Основы

вершения ферментации следуют стадии концентри-

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. После отделения кле-

рования и очистки полученного продукта. Выбор спо-

точной массы из культуральной жидкости осаждают

соба очистки зависит от целей использования

низкомолекулярные продукты, например аминокис-

продукта. Так, вещества, которые в дальнейшем бу-

лоты или лимонную кислоту. Процедура выделения и

дут применяться в фармакологии и при проведении

очистки антибиотиков включает несколько этапов

клинических анализов, подвергаются очень тщатель-

экстракции органическими растворителями (напри-

ной очистке, в то время как препараты ферментов

мер, н-бутилацетатом). Белки, в том числе и фер-

для технического использования часто содержат при-

менты, часто выделяют фильтрованием через мемб-

меси. Стоимость очистки продукта может составлять

раны. Для осаждения белка после фильтрования в

более 50% всех затрат на его производство, поэтому

раствор добавляют соли – сульфат аммония или на-

разработка усовершенствованных методов, позволя-

трия до высоких концентраций (высаливание). Для

ющих снизить расходы на очистку без потерь качест-

каждого белка характерна специфическая концентра-

ва продукта, имеет важное экономическое значение.

ция солей, достаточная для осаждения. Большинство

Особое внимание уделяется переработке отходов,

белков осаждаются при содержании соли 10–50%.

образовавшихся при выделении и очистке продукта

Другой способ выделения белка заключается в экс-

(например, клеточной массы).

тракции: для этого в раствор добавляют небольшое

КЛЕТОЧНАЯ МАССА. При производстве пекарских

количество (2–10%) охлажденного органического

дрожжей биотехнологическим продуктом является

растворителя, например 2-пропанола. Для техниче-

клеточная масса. Осажденные центрифугированием

ских целей ферменты используются в виде фильт-

клетки промывают и пропускают через ротационный

рата в жидком или высушенном виде.

вакуумный фильтр барабанного типа или пластинча-

КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ. Одновременное вы-

тый фильтр. Полученный продукт в полусухом виде

деление нескольких продуктов в одном резервуаре

высушивают распылением. В последнем случае срок

позволило бы значительно сократить время процесса

хранения, например, дрожжей значительно увеличи-

и общую площадь производства. Однако на практике

вается. Для сбора клеток также используют фильтра-

такие возможности удается реализовать очень ред-

цию клеточной суспензии.

ко. Интересным примером является создание про-

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. Для выделения вну-

мышленной установки, в которой объединены проце-

триклеточных продуктов клетки должны быть разру-

дуры отделения клеток и очистки продукта. В этой

шены. Разработано множество способов разрушения

установке клеточный бульон пропускают через не-

клеток, однако в промышленности наиболее распро-

сколько неподвижных слоев ионообменной смолы.

странены физические методы с использованием

Экстракция в двухфазной системе, состоящей из не-

шаровых мельниц или гомогенизаторов высокого

смешивающихся водных растворов солей или поли-

давления. Для разрушения клеточной стенки в мяг-

меров, – еще один перспективный метод выделения

ких условиях используют ферменты. В лабораторных

биотехнологических продуктов.

условиях клетки, как правило, разрушают ультразву-

ком или ферментативными методами (например,

клетки E. coli обычно обрабатывают лизоцимом

в присутствии неионных ПАВ). В зависимости от на-

личия сигнальной последовательности белки нахо-

дятся в цитоплазме или в периплазматическом про-

странстве. Рекомбинантный белок может оказаться в

218

составе телец включения за счет образования ано-

мальных дисульфидных связей. После мягкого раз-