Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

методов

Промышленные процессы ферментации

ВВЕДЕНИЕ. Переход от процесса, разработанного

300 л, а в промышленности применяются реакторы с

биотехнологических

в лаборатории, к промышленному производству не

рабочим объемом до 500 м3. При ферментации в

сводится к простому увеличению масштаба. В зави-

больших объемах значительными оказываются энер-

симости от технологического процесса используются

гетические затраты на обеспечение быстрого пере-

различные конструкции биореакторов, среди которых

мешивания среды и отвода тепла для сохранения по-

наибольшее

распространение получили

реакторы

стоянной температуры. В масштабных производствах

с перемешиванием. Обычно процесс перехода к

(например, производстве глутаминовой кислоты,

большим объемам производства осуществляется по-

белков одноклеточных организмов или при очистке

этапно (30 л → 300 л → 3000 л → промышленные

стоков) используют эрлифтные реакторы объемом до

масштабы).

1500 м3, в которых аэрация осуществляется за счет

МАСШТАБИРОВАНИЕ. Уже на уровне эксперимен-

внутренней или внешней рециркуляции газа.

Основы

тальных цехов биореакторы снабжены мешалками,

КОНТРОЛЬНО-ИЗМЕРИТЕЛЬНАЯ АППАРАТУРА. Конт-

турбинами, насосами и специальными устройствами

роль условий культивирования необходим и в экспе-

для аэрации. Все эти инженерные приспособления

риментальных установках для подбора оптимальных

необходимы для создания оптимальных условий

параметров, и в ходе производственного процесса.

культивирования клеток. При переходе к промышлен-

Обычно измеряют следующие характеристики: вес

ным масштабам производства необходимо учиты-

клеточной массы, температуру культуральной жидко-

вать, что в больших реакторах время перемешивания

сти, скорость вращения и потребляемую мощность

должно быть значительно увеличено. Для того чтобы

перемешивающих устройств, содержание кислорода и

в реакторе объемом более 150 м3 достичь обычной

рН среды. Часто в отработанных газах анализируют

для небольших объемов скорости вращения мешал-

содержание СО2 (методом ИК-спектроскопии) и О2

ки, потребуются огромные энергозатраты. Из этих же

(методом парамагнитного резонанса). По результа-

соображений крайне редко в промышленности ис-

там всех анализов получают полную картину техноло-

пользуют рекомбинантные организмы, содержащие

гического процесса. Состав продукта и расход суб-

плазмиды с промотором фага λ: при повышении

страта определяют путем периодического отбора проб

температуры, что необходимо для индукции генов

без нарушения стерильности системы. Из-за больших

под λ-промотором, может нарушить стабильное те-

затрат на проведение ферментации и высоких цен на

чение процесса в большом реакторе. При расчете па-

сырье, ведется постоянный поиск возможностей для

раметров аэрации учитывают повышенную чувстви-

снижения затрат (технологический процесс получения

тельность клеток стрептомицетов, Aspergillus и

продукта с рыночной ценой около 10 евро/кг в фер-

Penicillum к механическому воздействию. Аналогич-

ментере объемом 100 м3 с выходом продукта 100 г/л

ные аспекты принимают во внимание, когда рассмат-

обходится в 100 000 евро).

ривают прохождение газа через среду, а также отве-

ПРОБЛЕМА ПЕНООБРАЗОВАНИЯ В ФЕРМЕНТЕРАХ.

дение образовавшегося

тепла с

помощью

Интенсивная аэрация жидких сред, содержащих бел-

теплообменников.

ки, часто сопровождается нежелательным пенообра-

ТИПЫ БИОРЕАКТОРОВ. Первыми в промышленности

зованием. Для предотвращения этого обычно ис-

были применены поверхностные реакторы (для про-

пользуют механические сбиватели пены, а при

изводства лимонной кислоты) и пленочные биореак-

образовании слишком большого количества пены в

торы (биофильтры для аэробной очистки сточных

среду добавляют химические пеногасители (напри-

вод). Такие конструкции относительно просты в экс-

мер, эруковую кислоту или силиконы). Однако следу-

плуатации, однако удельный выход продукта невелик.

ет помнить, что присутствие химических реагентов

В современной промышленности наибольшее рас-

может значительно усложнять процедуру очистки

пространение получили реакторы с перемешивани-

продукта, поэтому стараются использовать мини-

ем, снабженные системой контроля температуры и

мальные количества пеногасителей.

интенсивности аэрации, вентилями для отбора проб и

стерильными

элементами

конструкции (трубы

и т. д.). В процессах с многоступенчатой фермента-

цией используются реакторы с лопастными мешалка-

ми, а в случае одноклеточных организмов эрлифт-

ные реакторы или барботажные колонны. При

производстве уксусной кислоты и аэробной очистке

сточных вод применяют мешалки, засасывающие

210

воздух при вращении. Реакторы для исследователь-

ских целей, как правило, имеют объем не более

методов

Биореакторы для культивирования животных клеток

ВВЕДЕНИЕ. За последние десятилетия разработаны

ча – создание системы, которая бы эффективно снаб-

биотехнологических

различные методы культивирования животных кле-

жала клетки кислородом, не разрушая их. Оптималь-

ток. Одной из самых сложных задач была оптимиза-

ное значение коэффициента массопередачи кислоро-

ция питательной среды. Некоторые белки, имеющие

да kLa для животных клеток составляет 2,2 в час (для

важное значение для медицины, могут быть получе-

микроорганизмов эта величина на 1–2 порядка боль-

ны в активной форме только в животных клетках.

ше). Разработано несколько способов «непрямого»

К таким белкам относятся человеческие антитела,

снабжения клеток газом, например с помощью полу-

фактор VIII, тканевой активатор плазминогена и др.

проницаемых мембран из силикона. Таким образом, в

Для их производства используют биореакторы объе-

реакторе объемом 1000 л с вращающейся мембраной

мом до 10 000 л. Как и в случае микробной фермен-

при давлении до 6 бар интенсивность снабжения кис-

тации, при культивировании животных клеток высо-

лородом достигает 120 г О2/(м3·ч). Цены на пита-

Основы

кие требования предъявляются к перемешиванию и

тельные среды для животных клеток очень высокие,

аэрации клеточной суспензии. Обычно белки, полу-

поэтому важно рационально использовать эти среды.

ченные в животных клетках, очень тщательно очища-

При непрерывном культивировании перфузионным

ют, избавляясь не только от примесей других белков,

способом клетки удерживаются в среде посредством

но и от следовых количеств ДНК или РНК (в особен-

мембранного фильтра с микропорами. При дости-

ности ретровирусной).

жении необходимой плотности клеток начинается пе-

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. Наряду с интенсивным снаб-

реработка биопродукта в непрерывном режиме. Таким

жением клеток кислородом и CO2 для успешного

образом удается поддерживать систему в равновес-

культивирования животных клеток необходим пра-

ном состоянии (т. е. осуществлять культивирование и

вильно подобранный состав питательной среды.

производство продукта) на протяжении более 900 ч.

В качестве источника углерода обычно используют

Процесс образования продукта в клетках, иммобили-

глюкозу. В питательной среде должны присутство-

зованных на микрочастицах, также может быть весь-

вать также аминокислоты, витамины, белки, жирные

ма продолжительным (до 30 сут.). В современной

кислоты, неорганические соли и другие вещества,

промышленности метод непрерывного культивирова-

необходимые для роста клеток. Ранее в среды доба-

ния используется исключительно для суспендирован-

вляли сыворотку крови быка: в ней содержится боль-

ных клеток в масштабах до 10 000 л на средах, не со-

шое количество белков, необходимых для роста

держащих сыворотки.

культуры животных клеток, однако эта сыворотка

ОЧИСТКА ПРОДУКТА. В отличие от большинства про-

очень дорогая, при этом существует высокий риск за-

цессов микробной ферментации для очистки продукта

ражения культуры вирусами или бактериями. В сре-

животных клеток нет необходимости в разрушении

ды, не содержащие сыворотки, вносят трансферрин,

клеток, так как он секретируется в среду роста. В то

инсулин, сывороточный альбумин и липопротеины.

же время для продукта животных клеток требуется

Для поддержания постоянного уровня рН в среду

очень тщательная очистка, которая, кроме идентифи-

культивирования добавляют бикарбонаты или прово-

кации продукта (пептидное картирование, определе-

дят все операции в атмосфере СО2.

ние аминокислотной последовательности, масс-спек-

ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ. В лабораторных условиях

трометрия MALDI-TOF, двумерный электрофорез

культивирование животных клеток проводят в рол-

белков) включает контроль отсутствия онкогенной и

лерных бутылях или специальных флаконах. Если

способной к трансформации ДНК животных клеток.

требуется больший объем (до 10 л), используют

В фармацевтическом препарате должна полностью от-

спиннерные емкости. В таких условиях удается дос-

сутствовать ретровирусная РНК, и может содержаться

тигнуть концентрации клеток 1–2 млн/мл.

не более 100 пикограмм (10–10 г) ДНК на дозу.

КЛЕТОЧНЫЙ РЕАКТОР. При переходе к биореакторам

необходимо помнить о том, что в ходе непрерывной и

периодической ферментации могут образовываться

токсичные вещества, ингибирующие синтез рекомби-

нантного продукта. В случае перфузионных культур

среду роста регулярно обменивают на свежую. Из со-

ображений безопасности (снижение риска распро-

странения инфекции) в промышленности, как прави-

ло, используют периодическую ферментацию.

Животные клетки в культуре очень чувствительны к

214

любым изменениям среды и механическим воздейст-

виям, поэтому возникает сложная инженерная зада-