Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Скачать

Заказать новую работу

Внимание! Если размещение файла нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам

микробиологии

Усовершенствование штаммов микроорганизмов

ВВЕДЕНИЕ. Микроорганизмы, выделенные из при-

антибиотика и с антибиотиком (например, с пеницил-

 

 

родной среды обитания, редко полностью отвечают

лином). Основными преимуществами такого метода

 

требованиям биотехнологического производства. По-

является возможность проводить одновременный

 

этому необходимым подготовительным этапом явля-

анализ большого количества полученных мутантов

Основы

ется многократное повторение мутагенеза и последу-

(несколько сотен на одной чашке). В результате дей-

ющего отбора мутантов, обладающих искомыми

ствия сильных мутагенных факторов часто происхо-

свойствами. Наиболее часто задачей таких экспери-

дят изменения в нескольких генах, поэтому необхо-

ментов является получение штаммов, продуцирую-

димо проверить не только способность мутантов

щих больше целевого вещества и меньше побочных

образовывать необходимый продукт, но и сохран-

 

продуктов или обладающих лучшими технологиче-

ность свойств, характерных для дикого штамма. Для

 

скими характеристиками (сокращение времени фер-

этого отобранные клетки выращивают в качалочных

 

ментации, отсутствие нежелательной пигментации,

колбах в условиях, максимально приближенных к та-

 

устойчивость к бактериофагам и др.). Одним из пре-

ковым в производственном процессе, и отбирают

 

имуществ микроорганизмов является их короткий

клетки, обладающие улучшенными свойствами. Пов-

 

жизненный цикл (часто менее 1 ч). Это позволяет

торение нескольких раундов мутагенеза с последую-

 

достаточно быстро получать и анализировать боль-

щим отбором позволяет отобрать штаммы, которые

 

шое количество мутантов. При работе с эукариотиче-

наилучшим образом удовлетворяют всем требовани-

 

скими микроорганизмами (например, грибами)

ям технологического процесса. Для устранения не-

 

необходимо принимать во внимание процесс реком-

нужных приобретенных свойств полученные штаммы

 

бинации. Знание обмена веществ, его регуляции и

скрещивают с дикими штаммами.

 

структуры ДНК, кодирующей ферменты, позволяет

СЕЛЕКЦИЯ В НЕПРЕРЫВНОЙ КУЛЬТУРЕ. Отбор мутан-

 

модифицировать геном микроорганизмов, целена-

тов можно проводить в непрерывной культуре в фер-

 

правленно «выключая» или «активируя» те или иные

ментере: для этого клетки микроорганизмов выращи-

 

стадии обмена веществ (metabolic engineering).

вают в среде с мутагеном и осуществляют при этом

 

МУТАГЕНЕЗ. Вероятность спонтанной мутации в нор-

селективное воздействие, например постепенно за-

 

мальном гене (под действием естественных мутаге-

меняют один источник углерода на другой. В таких

 

нов или при репликации) составляет 10–6–10–7. Как

условиях выживают лишь те микроорганизмы, кото-

 

правило, такие мутации остаются «молчащими» из-за

рые в результате мутагенеза приобрели способность

 

генетической или функциональной супрессии или ста-

утилизировать новый источник углерода. Описанный

 

новятся мишенью системы репарации ДНК. Для усо-

способ, однако, не позволяет проводить отбор мутан-

 

вершенствования штаммов осуществляют более эф-

тов с повышенным выходом продукта.

 

фективный искусственный мутагенез: например, при

 

 

ультрафиолетовом облучении или при введении мута-

 

 

генных веществ. Путем изменения длительности му-

 

 

тагенного воздействия и путем подбора мутагенных

 

 

веществ удается варьировать частоту мутаций в клет-

 

 

ках. В результате действия мутагенных факторов, как

 

 

правило, 90–99% клеток погибают, а затем из остав-

 

 

шихся клеток отбирают мутантов, которые обладают

 

 

желаемыми фенотипическими признаками.

 

 

ОТБОР МУТАНТОВ В ПОВЕРХНОСТНЫХ КУЛЬТУРАХ.

 

 

Основным фенотипическим признаком, рассматри-

 

 

ваемым при усовершенствовании штаммов микроор-

 

 

ганизмов, является их способность образовывать

 

 

большое количество продукта. Для отбора мутантов,

 

 

удовлетворяющих этому требованию, разрабатывают

 

 

систему отбора. В качестве признака для отбора мо-

 

 

жет служить устойчивость к антибиотику, ядовитым

 

 

веществам или фаговой инфекции. Полученные пос-

 

 

ле проведения мутагенеза клетки высевают в чашки

 

 

Петри на твердые селективные среды, где вырастают

 

 

лишь те колонии, которые обладают необходимой ус-

 

200

тойчивостью. Для отбора ауксотрофных мутантов ре-

 

плики колоний помещают на питательную среду без

 

Усовершенствование штаммов микроорганизмов

Мутагенез

Механизм

Тип изменений

 

 

 

Физический метод

 

 

Ионизирующее (рентге-

Образование одноили двухцепочечных

Устойчивые генетические изменения

новское) облучение

разрывов в ДНК

 

Ультрафиолетовое

Образование димеров тимидина и цитозина Точечные мутации

облучение (~254 нм)

 

 

Химический метод

 

 

Нитрит

При дезаминировании аденина образуется

Точечные мутации

 

гипоксантин, а цитозина – урацил

 

Алкилирующие агенты

Алкилированные пурины

Точечные мутации

Аналоги оснований

Включаются в ДНК при репликации

Устойчивые генетические изменения

Акридиновый оранжевый

Интеркалирует в ДНК

Устойчивые генетические изменения

 

 

 

Биологический метод

 

 

Транспозоны

Переносят участки ДНК внутри хромосомы

Маркирование генов

Метод реплик и пенициллиновый метод

Пенициллиновый метод

Получение реплики

Клеточная суспензия бактерий, чувствительных

Штемпель со

 

 

к действию ампициллина

стерильной

 

 

Мутагенез

бархоткой

 

 

 

Смесь мутантных и диких клеток

 

 

 

 

 

Выращивание в полной

 

 

 

питательной среде

 

 

Мутанты и клетки дикого типа

 

 

 

Выращивание

 

 

 

на минимальной среде

Полная

Полная

 

с ампициллином

питательная среда

питательная

Клетки дикого типа погибают под действием ампициллина

с антибиотиком

среда

 

Ампициллин удаляют из

Инкубация

 

 

среды, выращивание на

в термостате

 

 

полной питательной среде

 

 

 

 

 

Вырастают только мутанты

 

 

 

Получение реплик

 

 

 

и посев на минимальную

Штаммы, устойчивые

Контрольная чашка

 

и полную среды

Ауксотрофные мутанты вырастают только

к антибиотику

с полной питательной

 

средой

на полной питательной среде

Селективные питательные среды

 

 

Выращивание при

Минимальная

Питательная среда

Питательная среда

неоптимальной

питательная среда

с индикатором на метаболит

с антиметаболитом

температуре

с метаболитами

 

 

«Температурные»

Ауксотрофные мутанты – «Катаболические» мутанты – Регуляторные мутанты –

 

мутанты

дефект в биосинтезе

дефект фермента, разлагаю-

измененная скорость синтеза

 

 

некоторого компонента*

щего определенный субстрат

фермента или продукта

 

Питательная среда, тес-

Питательная среда и тес-

Питательная среда и казеин

Питательная среда

 

товые штаммы патоген-

товые штаммы патоген-

 

и трибутирин

 

ных микроорганизмов

ных микроорганизмов

 

 

 

и β-лак-

 

 

 

 

тамаза

 

 

 

 

«Лактамазная» устой-

Повышенный выход

Повышенный выход

Повышенный выход липаз

 

чивость: устойчивые

антибиотика

протеиназ

 

 

к лактамазе продуцен-

 

 

 

 

ты антибиотиков

* Выводы делают после получения реплик и применения пенициллинового метода

201

 

 

 

 

Основы биотехнологических методов

202

Микроорганизмы: рост в искусственных условиях

ВВЕДЕНИЕ. Микроорганизмы культивируют как на твер-

ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ.

дых, так и в жидких средах. Для лабораторной работы в

Большинство микроорганизмов, использующихся в про-

первом случае обычно используют чашки с агаризован-

мышленности, растут в аэробных условиях и являются

ной питательной средой, во втором – качалочные колбы

гетеротрофами. Для их роста необходимы органические

небольшого объема (обычно до 0,5 л). Культивирова-

соединения в качестве источника углерода и энергии,

ние промышленных микроорганизмов осуществляется в

а также азот, соли и микроэлементы (например, ионы

биореакторах. Полноценный состав питательной среды,

некоторых переходных металлов и витамины). Подбор

своевременное добавление тех или иных компонентов в

оптимального состава питательной среды для каждого

процессе роста клеток и оптимальные условия культи-

микроорганизма проводят при выращивании культуры в

вирования обеспечивают максимальный выход продук-

качалочных колбах небольшого объема. Важнейшими по-

та. Во избежание заражения промышленной культуры

казателями, определящими пригодность той или иной

другими микроорганизмами все операции по возможно-

среды роста, является выход продукта, а также относи-

сти проводятся в стерильных условиях.

тельная стоимость сырья, необходимого для ее пригото-

КАЧАЛОЧНЫЕ КОЛБЫ используют для культивирова-

вления. Так, в производстве этанола или лимонной кис-

ния микроорганизмов в жидкой питательной среде.

лоты стоимость сырья составляет более 50% стоимости

В лабораторной практике широко распространены кони-

полученного продукта. Экономически более выгодно ис-

ческие колбы объемом 50–500 мл – колбы Эрленмей-

пользовать в промышленности дешевые натуральные

ера, названные по имени немецкого ученого, впервые

среды, имеющие не очень строго контролируемый со-

применившего колбы такой формы. Специальные пере-

став, такие как кукурузный крахмал, меласса или соевая

мешивающие платформы, на которые помещают колбы

мука. В лабораторных исследованиях обычно готовят ис-

с культурой микроорганизмов, обеспечивают доступ

кусственные среды, в которые входят только химически

кислорода ко всем клеткам. Для культивирования ана-

чистые соединения (например, глюкоза и смесь амино-

эробных микроорганизмов среду стерилизуют, деаэри-

кислот) в определенной концентрации.

руют и все последующие операции проводят в бескис-

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД. В лабораторных

лородной среде в присутствии восстанавливающих

условиях питательные среды стерилизуют главным об-

агентов, например тиогликолята.

разом в автоклавах. Споры термофильных бактерий те-

БИОРЕАКТОРЫ (ферментеры) имеют объем от 1 л

ряют жизнеспособность после 15-минутного прогрева-

до 500 м3. Чаще используются реакторы с механиче-

ния среды при 121°С (за тестовый организм принят

ским перемешиванием, в которых равномерное распре-

Bacillus stearothermophilus). В этих условиях многие пи-

деление кислорода осуществляется с помощью меша-

тательные вещества, в том числе глюкоза и витамины,

лок, благодаря чему пузырьки поступающего воздуха

нестабильны, поэтому растворы, содержащие эти ве-

становятся меньше и разносятся по всему объему реак-

щества, стерилизуют фильтрацией через специальные

тора. В применяемых промышленных биореакторах мо-

бактериальные фильтры. Промышленную стерилизацию

гут осуществляться процессы ферментации трех типов:

больших объемов питательных сред (более 10 л) ранее

периодическая ферментация, периодическая фермента-

осуществляли обработкой паром под давлением

ция с добавлением субстрата и непрерывная фермента-

1,4–3 бар. Этот процесс является чрезвычайно продол-

ция. В промышленности, как правило, осуществляют

жительным (для нагревания и охлаждения емкостей

ферментацию первого или второго типа, в то время как

требуется несколько часов) и энергоемким. Кроме того, в

непрерывная ферментация имеет большое значение для

результате длительной термообработки некоторые ком-

фундаментальных иследований, так как позволяет под-

поненты питательной среды претерпевают необратимые

держивать постоянную концентрацию специфических

изменения. В современной промышленности применяют

компонентов среды в течение длительного времени

биореакторы с непрерывной стерилизацией, когда пита-

(до нескольких недель). Синтез метаболитов протекает

тельная среда нагревается струей перегретого пара до

наиболее интенсивно, когда клетки находятся в стацио-

140 °С в течение 2–3 мин. Противоток пара препятству-

нарной фазе, однако к этому моменту часто истощаются

ет образованию конденсата, и при этом экономится до

ресурсы среды. В то же время рост многих микроорга-

90% энергии. Подаваемый вместе с паром воздух пред-

низмов подавляется при высоких концентрациях глюкозы

варительно очищают пропусканием через фильтр, так как

в среде – так называемое ингибирование избытком суб-

1 м3 воздуха может содержать до 2000 различных штам-

страта, поэтому с самого начала нельзя добавлять избы-

мов микроорганизмов, среди которых 50% – споры гри-

ток питательных веществ в среду роста. Чтобы избежать

бов, 40% – грамотрицательные бактерии. Если в биореа-

замедления роста при избытке субстрата и продлить вре-

кторе интенсивность аэрации составляет один объем

мя продуктивного синтеза, т. е. повысить выход продук-

воздуха на один объем жидкости в минуту, то для стери-

та, по окончании фазы роста в среду добавляют новые

лизации биореактора с рабочим объемом 100 м3 требует-

питательные вещества в концентрированном виде.

ся около 6000 м3 стерильного воздуха в час.

Качалочная колба

Пропускающая воздух ватная пробка

Суспензия клеток, перемешиваемая при

враще-

нии

Питательные среды

Реактор с перемешиванием

Стерильная питательная среда

Пар/стерилизация

Контроль температуры

Подача воды для нагревания или охлаждения реактора

Мешалка

Выход газа

 

Контроль

рН

Отвод воды для нагревания или охлаждения реактора

Стерильный воздух

Компоненты

Источник

Состав/примечания

 

 

 

 

Многокомпонентные источники углерода

 

 

Меласса сахарной свеклы

Производство сахара

~ 48% сахарозы

Меласса сахарного тростника

 

~ 33% сахарозы,

 

 

~ 22% инвертированного сахара

Экстракты переработки

Производство крахмала и патоки

2–3% глюкозы, 11–13% лактозы

кукурузного сырья

 

 

 

Барда

Производство спирта

Различный

Крахмал и декстрины

Кукуруза

Различный

Отработанный щелок

Целлюлозно-бумажная

2–4% гексозы и пентозы

(сульфитный щелок)

промышленность

 

 

Молочная сыворотка

Молочная промышленность

3% лактозы

Углеводороды

Нефтехимия

Алифатические алканы

 

 

(более пяти атомов углерода)

Однокомпонентные источники углерода (в искусственных питательных средах)

 

 

 

 

Глюкоза

 

Для большинства организмов

 

Маннит

 

Для роста стрептомицетов

Метанол

 

Для роста многих бактерий и дрожжей

 

 

 

Многокомпонентные источники азота

 

 

Соевое молоко, арахисовая мука, пшеничные отруби,

Белок 20-26%, витамины и микроэлементы

экстракты переработки кукурузного сырья,

 

 

обезжиренное сухое молоко, дрожжевой экстракт

 

 

Однокомпонентные источники азота

Соли аммония, нитраты, мочевина, аминокислоты

Витамины, микроэлементы

Тиамин, рибофлавин, пиридоксин, никотиновая кислота, амид никотиновой кислоты, пантотеновая кислота, цианокобаламин, фолиевая кислота, биотин, α-липоевая кислота, пурины и пиримидины, гемины

Макроэлементы (10–3–10–4 моль): соли K, Ca, Mg, Fe, S, P

Микроэлементы (10–6–10–8 моль): соли Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, V, B, Cl, Na, Si

Цены на источники углерода

 

Кукурузный крахмал

 

 

 

 

50

 

 

 

 

Сырая нефть

 

 

 

 

(евро за 100 кг)

 

Рыночная стоимость

 

 

 

 

 

(долларов США

 

 

 

 

Пшеничный крахмал

 

 

 

 

 

 

за баррель)

30

 

 

 

(евро за 100 кг)

 

 

 

 

 

 

 

10

 

 

 

 

 

 

 

Сахар-сырец

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

(центов за фунт)

 

1988

1990

1992

1994

1996

1998

2000

2002

2004

Годы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

203

Основы биотехнологических методов

204

Кинетика образования продуктов метаболизма и биомассы в культуре микроорганизмов

ВВЕДЕНИЕ. Закономерности клеточного роста достаточно хорошо изучены для одноклеточных микроорганизмов. Грибы и стрептомицеты образуют мицелий, для них значительно сложнее описать процесс роста: по мере их роста увеличиваются число и размеры гиф мицелия. Кинетика образования метаболитов, т. е. типы ферментации, весьма разнообразны.

КИНЕТИКА РОСТА ОДНОКЛЕТОЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. К одноклеточным микроорганизмам относятся большинство бактерий, а также дрожжи. Эти организмы размножаются делением. За ростом клеточной массы можно наблюдать с помощью оптических методов, например непрерывно измеряя оптическую плотность (поглощение света определенной длины волны) среды. Для клеток, культивируемых в условиях периодической ферментации, выделяют шесть фаз клеточного роста. За лаг-фазой, во время которой происходит адаптация клетки к новым условиям и синтез ферментов, необходимых для роста, следует короткая промежуточная фаза I (фаза ускорения), а затем в течение относительно длительного периода удельная скорость роста клеток остается постоянной. Эта фаза называется экспоненциальной: рост клеток описывается кинетическим уравнением первого порядка. За экспоненциальной фазой следует промежуточная фаза II: замедление клеточного роста происходит из-за истощения питательной среды, накопления токсичных для клетки метаболитов и высокой плотности популяции. Культура переходит в стационарную фазу: в это время число клеток остается постоянным, однако именно в это время может происходить образование важнейших вторичных метаболитов, в том числе антибиотиков. Завершающая стадия – фаза отмирания – период, когда все процессы метаболизма в клетке останавливаются. Самые важные параметры, которые можно определить по кривой роста: 1) продолжительность лаг-фазы, которая зависит от физиологического состояния посевного материала к моменту инокуляции, а также от различия между составом среды, где клетки росли ранее, и составом новой культуральной среды; 2) удельная скорость роста (ч–1) связывает скорость роста клеточной массы и концентрацию клеток в реакторе. В экспоненциальной фазе величина постоянна, однако для промежуточной фазы II удельная скорость роста зависит от концентрации лимитирующего субстрата S. Эта зависимость выражается урав-

нением Моно: = max S/(KS + S), где KS (мг/л) – концентрация лимитирующего клеточный рост пита-

тельного вещества, при которой удельная скорость вдвое ниже максимального значения. Уравнение Моно имеет ту же форму, что и уравнение скорости ферментативной реакции, предложенное Михаэлисом и Ментен, и является математическим упроще-

нием при моделировании. Иногда вместо удельной скорости роста используют время генерации или время удвоения – время, за которое происходит удвоение числа клеток в экспоненциальной фазе. Часто оказывается, что количество клеточной массы, образующейся в процессе клеточного роста, пропорционально массе утилизированного клетками субстрата. Экономическим коэффициентом называют соотношение между приростом клеточной массы и потребляемым субстратом, при этом под субстратом в данном случае понимают не только химические вещества (кислород, источники азота и углерода, фосфаты), но и физические параметры, например температуру. Если среда содержит несколько источников углерода, то иногда можно наблюдать ряд последовательных лаг-фаз. Это явление, называемое диауксией (двухфазным ростом), обусловлено изменением метаболизма в процессе роста: сначала клетки используют один источник углерода, а затем, когда он истощается, «перестраивают» свой метаболизм на утилизацию другого источника.

КИНЕТИКА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБРАЗУЮЩИХ МИЦЕЛИЙ. Рост грибов, а также прокариот, образующих мицелий, таких как стрептомицеты, сопровождается увеличением размеров мицелия (образующих его гиф). Рост таких организмов описывается очень сложной кинетикой.

ОБРАЗОВАНИЕ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА. Процессы образования продуктов метаболизма могут быть сопряжены или не сопряжены с клеточным ростом. Согласно исторической классификации, процесс ферментации, сопряженный с клеточным ростом, относят к типу I. Примером может служить образование этанола в ходе анаэробного роста дрожжей. При ферментации III типа конечный продукт синтезируется в клетках по окончании экспоненциальной фазы роста и является вторичным метаболитом. В качестве примера можно привести антибиотики и внеклеточные ферменты. Ферментацией II типа ранее называлось образование продукта по «ответвлениям» основных путей первичного метаболизма и, следовательно, без непосредственной связи с энергетическим обменом клетки, как, например, при синтезе лимонной кислоты или аминокислот. Согласно современным представлениям, процессы образования всех метаболитов в клетке взаимосвязаны, поэтому сейчас говорят только о ферментации I или III типа, т. е. о ферментации, сопряженной или не сопряженной с клеточным ростом.

Смотрите также:

«ДОХОДЫ, РАСХОДЫ И ПРИБЫЛЬ КОММЕРЧЕСКОГО БАНКА.»
«ДОХОДЫ, РАСХОДЫ И ПРИБЫЛЬ КОММЕРЧЕСКОГО БАНКА.»
Значение, сущность и содержание социально — педагогической деятельности в организации для детей-сирот и детей, оставшихся без попечения родителей
Проактивные методы PR-деятельности российских авиационных компаний «Россия», «Азимут»
__RGR2
__RGR2
_10_Эмиль Золя для эл версии
_11_А. Франс для эл версии
_3 тема - Диффузия