Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Основы микробиологии

196

Дрожжи

ВВЕДЕНИЕ. Дрожжи – это группа грибов, не имеющих типичного мицелия и размножающихся почкованием. К дрожжам относят представителей различных классов грибов. Дрожжи – гетеротрофные организмы, предпочитающие для роста кислые среды (рН 3,5– 5,0). Клеточная стенка этих организмов содержит хитин. В биотехнологии наиболее важные следующие дрожжи: Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha и Pichia pastoris.

SACCHAROMYCES CEREVISIAE (пекарские дрожжи) могут размножаться как в гаплоидной, так и в диплоидной форме, поэтому они являются излюбленным объектом для генетических исследований. Гаплоидные штаммы, используемые в лабораторной практике, принадлежат одному из двух типов спаривания – MATa или MATα. Скрещивание возможно только между представителями разных типов спаривания. Бесполое (вегетативное) размножение осуществляется почкованием гаплоидных или диплоидных клеток. При половом размножении происходит слияние двух гаплоидных клеток, и в результате мейоза образуются четыре гаплоидные аскоспоры. Выводы о генетических изменениях можно делать, исходя из визуального (с помощью микроскопа) анализа аскоспор (тетрадный анализ). Поскольку и в гаплоидной, и в диплоидной формах эти дрожжи – неприхотливая и устойчивая культура, для которой в оптимальных условиях время удвоения составляет всего 90 мин, S. cerevisiae – очень ценный объект для молекуляр- но-генетических экспериментов. Нуклеотидная последовательность генома S. cerevisiae полностью расшифрована (12 млн п.н. находятся в 46 хромосомах). Наличие в клетках внехромосомных элементов (2 -плазмиды, присутствующей в количестве 60–100 копий на клетку) также является преимуществом этого вида дрожжей, так как открывает новые возможности для осуществления рекомбинации. Для трансформации клеток S. cerevisiae разработано множество векторных конструкций: при использовании одних векторов чужеродная ДНК реплицируется в клетке независимо (YRP – yeast replicating plasmid и YEP – yeast episomal plasmid), а другие векторы позволяют чужеродной ДНК встраиваться в дрожжевые хромосомы (YIP – yeast integrating plasmid). Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC – yeast artificial chromosome) позволяют клонировать очень крупные фрагменты ДНК (600–1400 т. п. н.), поэтому их часто используют для создания геномных библиотек. Недостатком такой системы является высокая частота внутрихромосомной рекомбинации, поэтому в последнее время искусственные дрожжевые хромосомы все чаще заменяют на бактериальные искусственные хромосомы (ВАС). Около 6000 генов S. cerevisiae

ввысокой степени гомологичны генам человека, поэтому эти дрожжи часто служат в качестве модельной системы при изучении молекулярно-биологиче- ских механизмов обмена веществ. В биотехнологии они используются в пищевой промышленности, для производства алкогольных напитков, этанола, а также для промышленного получения рекомбинантных белков, например α-интерферона, и различных вакцин, в том числе поверхностного антигена вируса гепатита В. В отличие от систем экспрессии с использованием E. coli, в клетках S. cerevisiae белки претерпевают посттрансляционную модификацию (например, гликозилирование), поэтому дрожжи используют для получения эукариотических белков, для функционирования которых необходимы такие модификации.

CANDIDA UTILIS – представитель группы дрожжей, который формирует мицелий и размножается исключительно почкованием. В геноме C. utilis встречаются неканонические кодоны (например, CUG, обычно кодирующий лейцин, в этом организме кодирует серин), поэтому гетерологическая экспрессия в C. utilis крайне затруднена. Штаммы C. utilis применяют в биотехнологическом производстве внеклеточных ферментов, а в сельском хозяйстве – как кормовую добавку. Грибы рода Candida могут использовать в качестве источника углерода такие необычные вещества, как фракции нефти или сульфитсодержащие производные, поэтому они имеют особенно важное значение при утилизации различных отходов. Некоторые представители рода Candida для человека патогенные (Candida albicans).

PICHIA PASTORIS И HANSENULA POLYMORPHA – представители метилотрофных дрожжей, использующих

вкачестве единственного источника углерода метанол. Метилотрофные дрожжи активно изучаются с целью использования для экспрессии эукариотических генов. Так, в клетках Pichia pastoris удалось осуществить очень эффективный синтез различных белков: липаз, β-интерферона и фрагментов антител (до 12 г рекомбинантного белка на литр культуры).

SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE впервые были выделены из восточно-африканского пива (пиво на языке суахили – pombe). Геном S. pombe, распределенный всего между тремя хромосомами, полностью расшифрован: его размер составляет 12,6 млн п.н., что сравнимо с размером генома S. cerevisiae, но всего по трем хромосомам, несущим почти по 5000 генов.