Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

чеством тандемных повторов). Микросателлитным ДНК, на долю которых приходится около 20% последовательности ДНК в геноме млекопитающих, принадлежит важная роль в генетическом и физическом картировании геномов. Один из методов анализа ДНК-маркеров – это анализ ПДРФ (полиморфизм длины рестриктных фрагментов): геномную ДНК или кДНК родителей и потомков расщепляют эндонуклеазами рестрикции и сравнивают картины расщепления при помощи гель-электрофореза. Таким образом получают карты рестриктного полиморфизма, которые при благоприятном стечении обстоятельств коррелируют с признаками и могут быть использованы в селекции. Если положение одного из интересующих генов в последовательности геномной ДНК известно, с помощью метода ПЦР можно амплифицировать соответствующий участок и проанализировать различия последовательностей ПЦР-продуктов. Однако сначала надо получить достоверную информацию об экзон-интронной структуре соответствующего гена, т. е. о структуре мРНК после сплайсинга (по последовательности кДНК). Для коммерчески важных домашних животных, таких как куры, коровы и свиньи, на сегодняшний день созданы генетические карты, базирующиеся на наблюдениях за наследованием признаков, генов или ДНК-маркеров (рекомбинация путем кроссинговера при мейозе). При анализе сцепления можно получить данные о расположении генов и маркеров на хромосомной ДНК.

Биотехнология в сельском хозяйстве

168

Трансгенные животные

ВВЕДЕНИЕ. Трансгенных животных, в которых экспрессирован чужеродный ген (knock-in) или выключен какой-либо собственный ген (knock-out), используют в фундаментальных исследованиях для моделирования некоторых заболеваний человека, для получения белков молока (генетическая ферма). В медицине наиболее важное модельное животное – мышь (Mus musculus), которую легко выращивать и которая по своим физиологическим особенностям близка к человеку.

ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ. Для того чтобы свести к минимуму побочные эффекты, обусловленные гетерозиготностью наследуемых признаков, трансгенных животных, как правило, получают из близкородственных линий. Линии мышей становятся практически полностью гомозиготными после 7–10 близкородственных скрещиваний. Для введения чужеродного генетического материала (knock-in) чаще всего используют микроинъекцию генной конструкции в пронуклеус эмбриональной стволовой клетки (ЭСК). Этот метод довольно быстрый, однако количество выживающих эмбрионов невелико. В качестве векторов используют генные конструкции, содержащие промотор, чужеродный ген с экзонами и интронами и сигнал полиаденилирования. Часто встраивание такого вектора в геном животного происходит в нескольких местах, то есть ген встраивается в нескольких копиях. Для выключения генов (knock-out) предпочитают проводить трансфекцию эмбриональных стволовых клеток in vitro. В результате кроссинговера или индуцированного двухцепочечного разрыва происходит рекомбинация между последовательностью ДНК и вектором, несущим последовательности, гомологичные последовательности исследуемого гена, но не кодирующие функциональный генный продукт, что приводит к инактивации природного гена. В составе вектора обычно присутствует маркерный ген, что позволяет контролировать эффективность встраивания. Другой способ носит название «генной ловушки» (gene targeting): репортерный ген встраивается в кодирующие или регуляторные последовательности собственных генов. Методом генной ловушки место встраивания определяется достаточно точно, и происходит интеграция только одной копии гена. Для выключения генов используют также антисмысловые конструкции. Потомков, содержащих новый рекомбинантный ген или выключенный ген в одной из своих половых клеток (химерные зародыши), используют для дальнейшего размножения в качестве животного-основателя.

ТРАНСГЕННЫЕ МЫШИ. Самок мышей, у которых в результате однократной внутрибрюшинной инъекции гонадотропина (HCG) была вызвана суперовуляция, скрещивают с самцами. Из яйцеводов выделяют морулу или бластоцисту, которые затем трансформируют. При трансфекции из бластоцист получают эмбри-

ональные стволовые клетки (ЭСК), которые являются плюрипотентными и могут размножаться в клеточной культуре. Их трансфицируют ДНК-вектором и внедряют обратно в бластоцисту. При микроинъекции вектор с чужеродной ДНК вводят в крупный мужской пронуклеус, который хорошо виден под микроскопом в оплодотворенной яйцеклетке. Трансформированные бластоцисты или яйцеклетки имплантируют в матку самкам, у которых в результате спаривания с вазэктомированным самцом была стимулирована ложная беременность.

ПРИМЕНЕНИЕ. В 1982 г. повышенный интерес ученых и общественности вызвало получение трансгенной «супермыши» путем микроинъекции гена гормона роста в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Если предполагается, что причиной какого-либо заболевания является мутация определенного гена, подтвержение этому можно получить, используя трансгенных животных: введение интактных генов (knock-in) должно привести к восстановлению нарушенной функции. Если фенотип животного становится нормальным, участие данного гена в возникновении болезни можно считать доказанным. У мышей со злокачественной опухолью активированный онкоген v-Ha-ras связывается с эмбриональным промотором, что при повреждении эпидермиса приводит к развитию рака кожи. Мышей этой линии можно использовать для тестирования различных мутагенов. Трансгенных мышей с мутациями в белке-предшест- веннике β-амилоида (АРР) используют в качестве модели для изучения болезни Альцгеймера. Мыши с ТКИД (тяжелым комбинированным иммунодефицитом) служат моделями иммунных заболеваний. В середине 2005 г. в свободной продаже появились тысячи трансгенных линий мышей. Поскольку анализ генома различных линий мышей уже завершен, использование трансгенных мышей облегчает функциональный анализ генома человека.