Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

ВВЕДЕНИЕ. Растительные клетки, подобно микроорганизмам или клеткам животных, могут расти в стерильных жидких средах (суспензионные культуры) при подаче воздуха в присутствии соответствующих фитогормонов. При высаживании таких клеток на твердую питательную среду можно получить эмбриоиды, из которых вырастают новые растения. Суспензионные культуры растительных клеток применяют: 1) для быстрого скрининга и отбора вариантов, обладающих особыми свойствами; 2) для получения культур протопластов и трансгенных растений; 3) для получения вторичных метаболитов в биореакторах.

МЕТОДЫ. Растительные клетки переносят из штаммовой или каллусной культуры в жидкую питательную среду, где они растут в присутствии источников углерода и азота, минеральных веществ и растительных гормонов. Для культивирования суспензионных культур используют качалочные колбы, размер которых может достигать нескольких кубических метров – в случае биореакторов с целью получения вторичных метаболитов.

СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ. Суспензионные культуры идеально подходят для поиска организмов, обладающих новыми признаками (например, устойчивостью к повышенной концентрации солей, большей устойчивостью к гербицидам, способностью синтезировать новые вторичные метаболиты). Такой скрининг осуществляется гораздо быстрее классических методов с долговременным анализом семян, поэтому он широко применяется, например, при работе с соевыми бобами, цитрусовыми, сахарным тростником, кукурузой, пшеницей и картофелем, прежде всего для получения гибридов растений, устойчивых к стрессу и патогенам. Недостаток такого подхода заключается в появлении нежелательных мутантов: это затрудняет регенерацию нормальных растений из культуры клеток, кроме того, они не всегда обладают искомыми признаками. Суспензионные культуры используют также для получения трансгенных растений, при этом необходимые модификации достигаются не скрещиванием и селекцией, а направленным переносом генов.

рильности, которая имеет большое значение для селекции, поскольку гарантирует успех перекрестного оплодотворения. Процесс слияния протопластов, полученных от разных растений, хорошо изучен (томаты и картофель – томофель), однако таким способом пока не удалось получить новые сорта.

БИОРЕАКТОРЫ С РАСТИТЕЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ.

Способность растительных клеток расти в виде генетически омнипотентной культуры позволила использовать их как источник ценного сырья. Так, в промышленных масштабах получают вторичные метаболиты, например шиконин, берберин или таксол. Использование растительных клеток для проведения одноступенчатых ферментативных реакций, например гликозилирования или гидроксилирования, не находит широкого применения, так как такие реакции значительно проще осуществлять с использованием микроорганизмов. Для получения вторичных метаболитов растительные клетки, обработанные растительными гормонами, переносят из каллусной культуры в суспензионную культуру, постепенно увеличивая ее объем в биореакторе. Используются самые разные типы биореакторов: реакторы с механическим перемешиванием, эрлифтные реакторы, барботажные колонны и др. Техническое обслуживание биореактора, как правило, не представляет большой сложности, однако серьезные проблемы связаны с нестабильностью высокопродуктивных линий клеток. Процесс биосинтеза и его регуляция для большинства вторичных продуктов обмена веществ еще не изучен.

ВВЕДЕНИЕ. Разработано несколько способов введения чужеродной ДНК в геном растений. Прежде всего, для трансформации двудольных растений, таких как томаты, табак, картофель, горох, фасоль, используют Ti-плазмиду Agrobacterium tumefaciens. Для одно- и двудольных растений, которые могут быть регенерированы из протопластов, применяют также методы электропорации или трансформации протопластов. Целые растения можно трансформировать при помощи микроинъекций или биолистики. Для доказательства успешности прохождения трансформации используют репортерные гены или методы ПЦР.

Ti-ПЛАЗМИДЫ. Почвенная бактерия A. tumefaciens может инфицировать двудольные растения и вызывать образование корончатого галла – опухолевого разрастания клеток на корнях растений. При этом в растение проникает Ti-плазмида (от англ. tumor inducing) размером примерно 200 п. н., а ее фрагмент порядка 15–30 п. н., так называемая T-ДНК, интегрирует в хромосомную ДНК растения. Для трансформации двудольных используют модифицированные Ti-плазмиды, которые остаются инфекционными, но не несут генов вирулентности. Помимо гена, который необходимо клонировать, они несут T-ДНК, точки начала репликации для Escherichia coli или для какоголибо другого организма-хозяина, с которым легко работать в лабораторных условиях, и репортерного гена. Для трансформации клеток культуры тканей их заражают рекомбинантным штаммом A. tumefaciens. Используя орган-специфические промоторы и лидерные последовательности, можно не только встроить Т-ДНК в определенное место, обеспечив экспрессию в листьях, корнях, многочисленных внутриклеточных компартментах (например, в хлоропластах или митохондриях), но и сделать экспрессию зависимой от внешних условий, таких как высокая температура, засуха, поражение патогеном, уровень освещенности или режим день/ночь. Для трансформации используют также Ri-плазмиды A. rhizogenes (возбудитель «кудрявости корней»). Растительные вирусы, например каулимовирусы или геминивирусы, не используются в качестве векторов, так как в них можно встраивать лишь небольшие фрагменты чужеродной ДНК, как правило, они инфицируют немногие виды растений, и схема их репликации чрезвычайно сложна.

трансформированы и другие однодольные. С помощью Ti-плазмид можно трансформировать протопласты однодольных. Возможно также применение других методов, основанных на работе с протопластами: микроинъекции, электропорация и обусловленное липосомами слияние, однако дальнейшая регенерация протопластов в нормальные растения чрезвычайно затруднена. В этом случае для трансформации растительных клеток используют метод биолистики. При этом зародыши растений бомбардируют золотыми или вольфрамовыми микрочастицами, на которых нанесена чужеродная ДНК.

ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА. Для этой очень важной практической цели используют два метода. Как в случае трансгенных животных, при гомологичной рекомбинации можно подавить экспрессию путем встраивания в ген чужеродной нуклеотидной последовательности (нокаутные растения). Однако эффективность этого метода при работе с растениями, в отличие от животных, очень мала. Большое распространение получил метод клонирования генамишени в антисмысловой ориентации под контролем соответствующего промотора. В трансформированном растении помимо нормальной смысловой мРНК с клонированного гена синтезируется антисмысловая РНК, которая образует комплекс с мРНК, и этот комплекс разрушается РНКазами как нефункциональный. В данном случае речь идет о статистическом процессе, происходящем с вероятностью 1–2%.

ГЕНОМ РАСТЕНИЙ. К настоящему времени полностью секвенированы геномы нескольких растений (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa – рис). Активно исследуются геномы кукурузы, табака, хлопка, пшеницы, ячменя, картофеля и других полезных растений.