Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Биотехнология в медицине

Биотехнология в медицине

Методы иммуноанализа

ВВЕДЕНИЕ. В то время как методы ферментативной диагностики уже позволяют достаточно быстро и достоверно определять отдельные компоненты сложных систем, методы иммунодиагностики пока существенно уступают в чувствительности и возможностях применения. Однако развитие радиоиммуноанализа (РИА) и иммуноферментного анализа (ИФА), а также техники гибридом послужило основой для создания иммунологических систем детекции, мировой рынок которых в настоящее время уже превысил 10 млрд долл. США в год.

МЕТОДЫ. Несмотря на высокое сродство антигенов

или гаптенов к антителам (kдисс 10–6–10–8 моль/л), анализ их связывания остается весьма сложной за-

дачей. Для оценки количества антигена в растворе часто используют метод конкурентного иммуноанализа, основанный, как следует из названия, на конкуренции между исследуемым и меченым антигенами за связывание с антителами. Чем больше антигена в исходном растворе, тем меньше репортерного антигена свяжется с антигеном. Все методы иммунодиагностики можно условно разделить на две большие группы: гомогенные методы анализа основаны на непосредственной реакции между антигеном и антителом, в то время как требующие бо’ льших затрат, но более чувствительные гетерогенные методы учитывают промежуточные стадии, в частности освобождение от несвязавшихся реагентов. Выбор метода анализа зависит от цели исследования, а также необходимой чувствительности. Чувствительность метода анализа повышается в случае нуклеотидов, содержащих радиоактивный изотоп (радиоактивную метку); при детектировании регистрируется сигнал, пропорциональный концентрации меченого вещества, а применение ферментативных реакций (твердофазный иммуноферментный анализ, ELISA – от англ. enzyme-linked immunosorbent assay) приводит к значительному усилению сигнала. При правильно подобранных условиях методом ELISA можно определять пикоили даже аттомолярные концентрации (10–12–10–13 моль/л). Репортерным ферментом «работает» чаще всего пероксидаза или кислая фосфатаза.

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ. Для количественной оценки взаимодействия антител и антигенов сравнивают значения, полученные для исследуемой пробы, со стандартными кривыми титрования. В лабораторной практике чаще всего используют планшеты с 96 или 394 лунками и соответствующий сканер (на основе фотометра, флуориметра или люминометра), который в автоматическом режиме осуществляет количественную оценку результата, сравнивая его со стандартными кривыми.

ТЕСТ-ПОЛОСКИ. В фармакологии широко известны тест-полоски – это и есть пример твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Так, тест на беременность основан на определении концентрации хорионического гонадотропина (ХГТ, или англ. HСG), содержание которого в крови и моче значительно повышается после оплодотворения яйцеклетки. Тестполоски также применяются в экстренной медицине, например, для установления поражения сердечной мышцы – инфаркта. При инфаркте в кровь выделяется белок тропонин Т. Кровь больного наносят на тестполоску, где при прохождении через специальные волокна она освобождается от эритроцитов. Затем по капиллярам жидкость поступает в реакционную зону тест-полоски, где происходит элюция специфических конъюгатов антител и образование комплексов типа «сэндвич». Если комплексы образуются, участок тест-полоски окрашивается за 15 минут в красный цвет. Для качественной оценки результата не требуется никаких специальных устройств – его можно наблюдать визуально, а количественные определения проводят с помощью специального прибора (с CСD-камерой).

ДРУГИЕ ПРИМЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОАНАЛИЗА.

Методы иммуноанализа находят широкое применение в клинической диагностике. Стремительный прогресс в понимании механизмов физиологических процессов, в частности регуляции обмена веществ, позволяет разрабатывать новые методы диагностики заболеваний на самых ранних стадиях. В пищевой промышленности иммуноанализ применяется для обнаружения запрещенных к применению добавок (например, казеин в колбасных изделиях). Иммунологическими методами можно быстро обнаружить присутствие патогенных микроорганизмов и их токсинов. Еще одно важное применение метода иммуноанализа – экологические исследования, например контроль загрязнения сточных вод и почвы различными ксенобиотиками и гербицидами.