Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

В90% случаев заболевание проходит бессимптомно, но в 5% приводит к хроническим болезням печени. По оценкам, в мире почти 1 млрд носителей вируса гепатита В. Для получения рекомбинантной вакцины из плазмы инфицированных доноров выделили поверхностный антиген HBsAg вируса гепатита

Ви осуществили экспрессию в различных клеткаххозяевах: культурах E. coli клеток млекопитающих и S. cerevisiae, но предпочтительнее – в культуре пекарских дрожжей. Экспрессированный белок очищали хроматографическими методами. Иммунохроматографические методы с использованием антител к HBsAg хотя и дали хорошие результаты, но этот метод очень дорогостоящий. Другим направлением развития нового поколения вакцин является получение аттенуированных штаммов. Например, по такой технологии был создан новый штамм Vibrio cholerеae для иммунизации против холеры. Холерный токсин, ответственный за патогенный эффект, представляет собой гексамерный белок с аденилатциклазной активностью. Под действием этого токсина концентрация цАМФ в тонком кишечнике увеличивается, что влечет значительные потери организмом жидкости и электролитов. Клиническими проявлениями холеры являются диарея и обезвоживание организма. Методами генетической инженерии удалось получить штамм V. cholerae, в геноме которого делетирован участок, ответственный за аденилатциклазную актив-

150 ность энтеротоксина. Такой измененный энтероток-

син вызывает полноценный иммунный ответ, однако не является патогенным. «Векторные» вакцины – еще одна новая стратегия иммунизации. В качестве вакцины при таком подходе используется вирусная ДНК, модифицированная таким образом, что она больше не оказывает патогенного действия, однако вызывает иммунный ответ. Для доставки вирусной ДНК в клетки выбран вирус коровьей оспы (Vaccinia). Геном этого вируса хорошо изучен, а сам вирус инфицирует клетки с высокой эффективностью и не опасен для человека. В геном Vaccinia можно встраивать различные вирусные антигены и наблюдать иммунный ответ. Так, на экспериментальных животных было подтверждено действие такой системы с G-белком вируса бешенства, с поверхностным антигеном гепатита В, с NP- и HA-белками вируса гриппа и с различными гликопротеинами Нerpes simplex. Стратегия «векторных» вакцин, несомненно, является многообещающей, однако ее серьезный недостаток заключается в риске развития вирусной инфекции у грудных детей, а также у лиц с ослабленным иммунитетом.

ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ. Программы иммунизации, основанные на использовании трансгенных растений, больше всего обсуждаются в странах третьего мира. Такие «съедобные вакцины» поступают в организм пероральным путем, поэтому особое внимание уделяется тому, каким образом вакцина проходит через желудочно-кишечный тракт и насколько эффективен иммунный ответ клеток слизистой оболочки. Использование трансгенных растений для иммунизации не исключено в будущем, однако пока такой подход вызывает множество вопросов, в том числе касающихся условий созревания, хранения и переработки плодов трансгенных растений, несущих вакцину.

ДНК-ВАКЦИНЫ (ГЕННАЯ ИММУНИЗАЦИЯ). После инъекции ДНК, кодирующей поверхностный белок возбудителя малярии Plasmodium falcuparum, в селезенке мышей образовывались антитела к этому паразиту. Эксперименты на мышах по экспрессии фрагментов генома Mycobacterium tuberculosis подтвердили возникновение Т-клеточного иммунного ответа. Удалось также выделить гены, ответственные за возникновение такого иммунитета. В обоих случаях антиген-специфическую ДНК встраивали в плазмиды. В настоящее время ДНК-вакцины лишь начинают разрабатываться.

Паразиты Бактерии Вирусы

Антитела против белка оболочки вируса гепатита В

Биотехнология в медицине

152

Антитела

ВВЕДЕНИЕ. Антитела – это белки, обеспечивающие защитную функцию иммунной системы. Они циркулируют в крови и лимфе позвоночных животных. Антитела обладают способностью высокоспецифично связываться с антигеном, в качестве которого может выступать чужеродный белок, токсин, полисахарид или липосахарид оболочки вируса или патогенного микроорганизма. Образование специфических антител начинается при попадании антигена в организм; при аутоиммунных заболеваниях такая реакция провоцируется собственными белками. Даже низкомолекулярные соединения (гаптены), будучи связанными с подходящими носителями, могут вызывать образование специфических антител. Метод пассивной иммунизации основан на использовании антител в качестве вакцин против инфекции и отравления токсинами. Антитела также находят широкое применение в лабораторной практике: они служат для выявления специфических белковых продуктов. Очистка рекомбинантных антител в промышленности осуществляется иммуннохроматографическими методами. СТРУКТУРА АНТИТЕЛ. К антителам относятся иммуноглобулины. Иммуноглобулины человека по структуре и функциям принято делить на пять классов: IgG, IgM, IgA, IgE и IgD. IgG, преобладающий среди других иммуноглобулинов сыворотки крови, представляет собой тетрамер из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей, соединенных дисульфидными мостиками. В молекуле иммуноглобулина различают константные (структурные) (CH, CL) и вариабельные (VH, VL) домены. Иммуноглобулины расщепляются протеиназой папаином на два Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Fc- фрагмент (от англ. fragment crystallizable – способный кристаллизоваться) взаимодействует с рецепторами на клеточной поверхности, а Fab-фраг- мент (от англ. аntigen binding fragment – связывающий антиген) связывает антиген. Антиген-связываю- щий фрагмент содержит участки, определяющие комплементарность антител к антигену (СDR – от англ. complementarity-determining regions). Эти участки называют гипервариабельными, так как они проявляют очень высокую изменчивость аминокислотной последовательности: 6 комплементарных областей построены из 20 аминокислот, следовательно, согласно комбинаторике, теоретически возможно 206 × 20 = 20120 вариантов строения Fab.

БИОСИНТЕЗ АНТИТЕЛ. Антитела синтезируются исключительно В-лимфоцитами. Огромное разнообразие антител обеспечивается благодаря тому, что для каждого типа цепей существует набор генных сегментов (в сумме их число превышает 1000), которые объединяются случайным образом в процессе рекомбинации. Кроме того, сам процесс рекомбинации при

образовании дочерних В-клеток оказывается не очень точным – часто происходят мутации (случайные выпадения или вставки нуклеотидов) в областях генов, кодирующих вариабельные участки иммуноглобулинов. Таким образом достигается большое разнообразие фенотипов иммуноглобулинов при сравнительно небольшом размере генома.

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ. Поликлональные антитела – это смесь антител, образованных В-лимфоцитами в ответ на введение антигена. Различные антитела узнают различные части молекулы антигена (эпитопы), поэтому препарат поликлональных антител всегда в какой-то мере гетерогенный. Обычно антитела выделяют из обогащенной антителами сыворотки крови, которую получают путем многократного введения антигена животным (кролику, овце, козе, корове, лошади). Иммунизацию можно повторять через 1–2 недели, и из крупных животных (лошади, коровы или козы) удается получать значительные количества сыворотки. Антитела из сыворотки выделяют осаждением и хроматографически. Для повышения специфичности сыворотки к определенному антигену применяют методы аффинной хроматографии с иммобилизованным белком А из Staphylococcus aureus. Этот белок (MR 42) с высокой специфичностью связывается с Fc-фрагментом IgG. Очищенный препарат IgG подвергают лиофилизации в стерильных условиях; его можно хранить в холодильнике в течение нескольких лет. Промышленное производство антител осуществляется в строгом соответствии с «Правилами организации производства и контроля качества лекарственных средств», принятыми Всемирной организацией здравоохранения.

РИСКИ. В организм антитела вводят парентерально (то есть в обход желудочно-кишечного тракта), так как в пищеварительном тракте они нестабильны. Антитела, полученные из животных, распознаются иммунной системой человека как чужеродные, поэтому при повторном введении возможно возникновение иммунной реакции. В медицине эту проблему решают частой сменой антител, полученных из различных животных. Альтернативой может быть использование антител, выделенных из крови доноров. Хотя в развитых странах существуют крупные банки донорской крови, где кровь доноров тщательно проверяется на наличие инфекционных агентов, все же риск заражения при использовании антител из крови доноров остается достаточно высоким.

Антитело С

Различные паратопы антитела

Различные эпитопы антигена

чае выход продукта может достигать нескольких граммов антител на литр культуры. Для концентрирования культуральной жидкости часто используют методы ультрафильтрации, после которой следует первичная очистка антител методом аффинной хромато-графии с белком А, а затем – тонкая очистка, включающая ионообменную и гель-хроматогра- фию для удаления посторонних белков и агрегатов антител.

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА. Медицинское применение мышиных моноклональных антител для лечения или диагностики заболеваний человека в системе in vivo влечет за собой риск возникновения иммунной реакции, так как антиген-связывающие участки антител мышей и человека могут значительно отличаться друг от друга. Иммунизация человека в экспериментальных целях невозможна по этическим соображениям, в то время как культивирование клеток миеломы человека является чрезвычайно сложной технической задачей. По этим причинам были разработаны другие методы получения антител: 1) в клеточных культурах лимфоцитов человека при добавлении в среду роста антигена и специфических факторов (таких как гормоны роста и цитокины) (иммунизация in vitro); 2) из селезенки иммунодефицитных мышей, которым введены лимфоциты человека; 3) получение рекомбинантных мышиных антител, несущих антиген-связывающие участки антител человека.