Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Использование протеиназ в производстве стиральных порошков

Тип протеиназы

Сериновые

Цистеиновые

Карбокси-

Металло-

протеиназы

протеиназы

пептидазы

протеиназы

Пример

Субтилизин

Папаин

Пепсин

Термолизин

Активность при рН 10

+

–

–

–

Стабильность при рН 10

(+)

–

–

–

Стабильность при 50°С

+

_

_

+

Устойчивость против

+

+

+

–

комплексообразования

Устойчивость к окислению

+

–

+

+

Устойчивость к ПАВ

~

~

~

~

Структура

Вектор трансформации

Промотор протеиназы

Точка начала

Субтилизин

репликации (ori)

Терминатор

Селективный

маркер

Субтилизин Карлсберга (1scb) (разрешение 0,23 нм).

Каталитический центр (Ser, Asp, His) изображен

Плазмида для экспрессии субтилизина Карлсберга

красным цветом; зеленым цветом обозначен Met222

в штамме-суперпродуценте Bacillus lentus

Ферментация и получение

Предферментация

Генетически модифицированные

штаммы-суперпродуценты Bacillus lentus;

10 м3, 24 ч при 35 °С

Основной процесс

120 м3, 48 ч при 35 °С, источник углерода –

декстрин, источник азота – соевая мука;

добавление казеина как индуктора

Более 15 г/л субтилизина через 60 ч

1 см

Отделение клеток и концентрирование

Микрофильтрация и ультрафильтрация, осаждение

Гранулирование

Гранулирование

в смесителях

Мелкие твердые частички

Мелкие твердые частички

(соль/сахар),

(соль/ПЭГ),

ловушка радикалов,

гранулирование

высушивание,

в специальных смесителях,

гранулы покрыты

высушивание,

ПЭГ*/TiO2

гранулы покрыты ПЭГ/TiO2

1 см

* ПЭГ – полиэтиленгликоль

85

Источник

Амилоза, %

Амилопектин, %

Температура образования

Способность

клейстера, °С

к набуханию, %

Картофель

18–23

77–82

56–66

> 1000

Пшеница

19–25

75–81

52–63

21

Кукуруза

21–30

70–79

62–72

24

Рис

17–19

81–83

61–78

19

Картофель

Пшеница

Кукуруза

Рис

Структура амилозы и амилопектина

Амило-

пектин

Амилоза

Ферментативный гидролиз крахмала

α-Амилаза (1,4-α-D-глюкан-4-глюканогидролаза,

ФК 3.2.1.1); расщепляет: α-1,4-связи с образова-

Амилоза

нием мальтоз и мальтотриоз

β-Амилаза (1,4-α-D-глюкан-мальтогидролаза,

Амилопектин

ФК 3.2.1.2); отщепляет мальтозу с восстанавли-

вающего конца

Смесь α-амилазы и глюкоамилазы/пуллуланазы;

Пуллулан

расщепляет амилозу и амилопектин до D-глюкозы

Невосстанавливающий конец

Мальтоза

Мальтотриоза

Ферменты

Фермент

Источник

Свойства

Условия применения

α-Амилаза

Bacillus licheniformis

Оптимальные условия 60 °С, рН 5,7,

95–105 °С, рН 6–7, Са2+

необходимо присутствие Ca2+

Aspergillus oryzae

Оптимальные условия 50–60 °С,

< 50 °С, рН > 3,5, Са2+

рН 5,0, необходимо присутствие Ca2+

Ячменный солод

Оптимальные условия 70 °С, рН 5,5

< 70 °С, рН > 4,5

β-Aмилаза

Bacillus

Стабильна при 75 °С, рН 5,0

Для получения мальтозного

stearothermophilus

сиропа

Пуллуланаза

Klebsiella pneumoniae

Оптимальные условия 70 °С, рН 5,5

55–65 °С, рН 3,5–5

Глюкоамилаза

Aspergillus niger,

Стабильна при 70 °С, рН 5,5

55–65 °С, рН 3,5–5

Rhizopus sp.

Ферменты

ВВЕДЕНИЕ. Объем производства крахмала составляет

значению DЕ, а также позволяет снизить расход

50 млн тонн в год, почти половина его подвергается

глюкоамилазы. Использование иммобилизованных

ферментативному гидролизу. При этом 15% исполь-

ферментов в этом случае неприемлемо из-за за-

зуются для получения так называемой изоглюкозы

медления диффузии в вязком растворе. Следующим

(«сиропа с высоким содержанием фруктозы»), а ос-

этапом является кристаллизация D-глюкозомоно-

тальной крахмал в виде декстринов и мальтозных си-

гидрата. В зависимости от количества глюкоамила-

ропов применяется в разнообразных технологических

зы и продолжительности осахаривания можно полу-

процессах, например как компонент питательной сре-

чать различные промежуточные продукты гидролиза

ды для ферментации. В Канаде и США сырьем при по-

крахмала: от мальтодекстрина до глюкозы и мальто-

лучении крахмала служат кукуруза и пшеница. По

зы. Глюкозные сиропы с различными значениями

сравнению с объемом крахмала, выделенного из этих

DE широко используются в кондитерской промыш-

культур, объем картофельного и рисового крахмала

ленности. Для получения мальтозных сиропов при-

незначителен. Во времена Наполеона, когда завоз

меняют α-амилазу, выделенную из Aspergillus niger.

продуктов, в частности сырья для производства саха-

Такие сиропы обладают рядом привлекательных тех-

ра – сахарного тростника, в Европу был ограничен,

нологических свойств: они не темнеют, в отличие от

гидролиз крахмала под действием неорганических ки-

многих других растворов полисахаридов, не склонны

слот был основным способом получения сахара. В со-

к кристаллизации, а также обладают повышенной

временной промышленности эта технология больше не

вязкостью.

используется.

ЦИКЛОДЕКСТРИНЫ. Под действием циклодекстрин-

ФЕРМЕНТАТИВНОЕ «РАЗЖИЖЕНИЕ» КРАХМАЛА.

трансферазы из декстринов образуются пяти-,

Кукурузный и пшеничный крахмал получают при пе-

шестиили семичленные кольца (α-, β- и γ-цикло-

ремалывании зерен в сухих или влажных условиях.

декстрины соответственно), построенные из остатков

При этом образуются такие важные побочные проду-

глюкозы. Эти вещества хорошо растворимы в воде,

кты, как кукурузное масло, кукурузный (или пшенич-

при этом размеры кольца настолько велики

ный) глютен и компоненты, которые используются

(0,5–0,75 нм), что в его полости могут разместиться

для составления кормовых смесей. Крахмал, поме-

другие молекулы, например витаминов, ароматиче-

щенный в реактор объемом более 100 м3, несколько

ских соединений или лекарственных средств. Таким

минут подвергают термической обработке паром

образом, циклодекстрины в основном обеспечивают

(105–140 °С) в присутствии термостабильной бакте-

«растворимость» нерастворимых веществ или стаби-

риальной α-амилазы. При инкубации получающегося

лизацию их взаимодействия с рецепторами. Хираль-

клейстера в течение 2–3 ч при температуре 95 °С

ный пул производных циклодекстринов используется

под действием бактериальной α-амилазы крахмал на

в качестве неподвижной фазы для хроматографиче-

98% гидролизуется до мальтодекстрина (декстроз-

ского разделения оптически активных веществ.

ный эквивиалент DE 15–25) – смеси олигосахари-

Наибольшее распространение получили β-циклодек-

дов, содержащей небольшие количества моно-, ди- и

стрины. Соответствующий фермент – циклодекст-

трисахаридов. Мальтодекстрин служит субстратом

рингликозилтрансфераза (циклодекстриназа) обна-

для дальнейшего осахаривания полисахарида. Кроме

ружен в клетках Bacillus, обитающих в нейтральных

того, он используется как компонент детского или ди-

или щелочных условиях. Промышленное получение

етического питания, а также входит в состав концент-

циклодекстринов из крахмала осуществляется в фер-

ратов супов.

ментных реакторах.

ФЕРМЕНТАТИВНОЕ «ОСАХАРИВАНИЕ». Этот процесс

ведет к образованию сиропа, содержащего глюкозу

и мальтозу. В ферментативном осахаривании глав-

ную роль выполняет фермент глюкоамилаза из As-

pergillus niger. Мальтодекстин охлаждают до темпе-

ратуры 60 °С и закисляют среду до рН 4,0. Как

правило, непрерывный технологический процесс

осуществляется в нескольких резервуарах, чтобы не

допустить потери продукта из-за разбрызгивания си-

ропа. Осахаривание (т. е. полный гидролиз) в при-

сутствии глюкоамилазы продолжается 48–72 ч;

продукт – глюкозный сироп с высоким декстрозным

88

эквивалентом, DE 97–98. Добавление пуллуланазы

или изоамилазы приводит к еще более высокому

Ферментативное расщепление крахмала

Гидролиз кукурузного крахмала

Мальтодекстрины DE 15–20

Глюкозный сироп DE 97

40% м/об, деионизованная вода,

2–4 ч при 95 °С,

рН 4,2, 60 °С, 2–3 сут.,

20 ppm Са2+, рН 6–6,5, 77–105 °С,

бактериальная α-амилаза

грибная глюкоамилаза

0,15% бактериальной α-амилазы

Крахмальное

Крахмал набухает

Степень гидролиза возрастает

молоко

и превращается

в клейстер

Пар

Варочный

Мальтодекстрин

Глюкозный

Подача водяного

аппарат

сироп DE 97

3 ч

пара, 5 мин при 105 °С,

термостабильная

при 95 °С

2–3 сут. при 60 °С

α-амилаза

Продукты ферментативного гидролиза крахмала

Гидролизат

Декстрозный

Фермент

Применение

эквивалент, DE*

Мальтодекстрин

15–25

α-Амилаза

В пищевой промышленности, имеет хорошее

сырье в производстве подсластителей

Мальтозный сироп

40–45

α-Амилаза,

Подсластитель

β-амилаза

Мальтоза

50–55

α-Амилаза,

Подсластитель

глюкоамилаза

Мальтозный сироп

60–70

α-Амилаза,

Подсластитель, сырье для ферментации

с высокой и сверх-

глюкоамилаза,

высокой степенью

пуллуланаза

осахаривания

< 80

Изоглюкоза

97

Глюкозоизомераза

Подсластитель

* Декстрозный эквивиалент оценивает степень гидролиза крахмала.

Циклодекстрины

Свойства циклодекстринов

Цикло-

декст-

рин

α

β

γ

Число

остатков

глюкозы

6

7

8

0,52 нм

MR

972

1135

1297

Растворимость

в воде,

100 г/мл

14,5

1,85

23,2

Диаметр

молекулы, нм

≥ 0,47

≥ 0,6

≥ 0,75

α-Циклодекстрин

Код CAS

10016-20-3

7585-39-9

17465-86-0

89