Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Ферменты

ВВЕДЕНИЕ. Сахар в нашей пище представляет собой

ПОЛУЧЕНИЕ. Глюкозоизомераза обнаружена во мно-

D-сахарозу. В западноевропейских странах сахар на-

гих микроорганизмах. Этот внутриклеточный фер-

чали употреблять в пищу в XVIII в. Изначально его по-

мент представляет собой гомодимер. В осуществле-

лучали из сахарного тростника, произрастающего в

нии каталитической реакции задействованы ионы

тропических и субтропических зонах, но когда при

Co2+, Mn2+ и Mg2+. На годовое производство в про-

Наполеоне Европа оказалась в экономической блока-

мышленных масштабах глюкозоизомеразы использу-

де, была разработана технология производства саха-

ют 1500 т стрептомицетов и Bacillus coagulans. Избе-

ра из сахарной свеклы. Использование ферментов в

жать дорогостоящей процедуры очистки фермента

современных производственных процессах позволя-

удается при использовании биореактора с иммобили-

ет превращать большие объемы кукурузного и пше-

зованными клетками штаммов-продуцентов глюкозо-

ничного крахмала в глюкозо-фруктозный сироп

изомеразы. В биореакторе с притоком воздуха весь

(«изоглюкоза»). При рациональном питании (низко-

процесс заканчивается за 72 ч. Смесь D-глюкозы и

калорийный рацион, диета диабетиков, профилактика

D-фруктозы, содержащая 42% D-фруктозы и назы-

кариеса) часто используют различные сахарозамени-

ваемая «изомеразой 42», образуется при 60 °С за

тели. Для оценки сладости вещества проводят срав-

30 мин. Биореактор имеет большое время эксплуата-

нение с 10% раствором сахарозы.

ции: «время полужизни» фермента при 60 °С –

ИНВЕРТИРОВАННЫЙ САХАРНЫЙ СИРОП. Гидролиз

50 сут. Модульная конструкция позволяет осуществ-

сахарозы, катализируемый инвертазой, приводит к

лять непрерывный процесс, в котором несколько био-

образованию смеси равных количеств D-глюкозы и

реакторов участвуют поочередно. В результате ген-

D-фруктозы, называемой инвертированным сахаром.

но-инженерной оптимизации штаммы-продуценты

Такой сироп обладает той же сладостью, что и трост-

глюкозоизомеразы, в отличие от природных штам-

никовый сахар, и не кристаллизуется, поэтому его

мов, не нуждаются в наличии кофактора Co2+. Про-

широко используют в кондитерской промышленности

дукт реакции содержит примеси карамелизованных

при производстве конфет и пралине. Инвертазу вы-

сахаров, которые удаляют с помощью активированно-

деляют из клеток пекарских дрожжей Saccharomyces

го угля. Фруктозный сироп поступает на предприятия

cerevisiae. Фермент локализован в цитоплазме, поэ-

пищевой промышленности в жидком виде.

тому процедура его выделения относительно проста:

D-ФРУКТОЗА обладает высоким показателем сладо-

после разрушения клеток удается выделить чистый

сти, ее получают из фруктозного сиропа или инвер-

фермент. Технология получения инвертированного

тированного сахара методом хроматографии. В клуб-

сахара из 70% сахарозного сиропа основана на ис-

нях топинамбура («земляной груши») содержится до

пользовании иммобилизованной инвертазы в фер-

75% инулина – полимера фруктозы. Гидролиз ину-

ментативном реакторе. Реактор работает в непре-

лина с образованием фруктозы катализирует фер-

рывном режиме в оптимальных условиях в течение

мент инулиназа.

нескольких дней при 55 °С.

ИЗОГЛЮКОЗА. Глюкозоизомераза, выделенная из

стрептомицетов Actinoplanes или Bacillus coagulans,

катализирует реакцию изомеризации D-глюкозы

в D-фруктозу. В оптимальных условиях (60 °С) об-

разуется сироп состава 42% D-фруктозы + 55%

D-глюкозы, сладость которого совсем немного

меньше, чем сладость сахарозного сиропа. Такой

сироп получил название «изоглюкоза 42». После

хроматографического выделения глюкозы и ее

изомеризации получают сироп с содержанием фру-

ктозы 55% (изоглюкоза 55). Этот продукт исполь-

зуется для производства слабоалкогольных напит-

ков. Изоглюкоза используется более чем в 40%

всех напитков и блюд с добавлением сахара, при-

чем более 80% предприятий расположены на тер-

ритории Северной Америки. В странах ЕС, согласно

межгосударственным соглашениям по регулирова-

нию экономики, производится только 500 000 тонн

90

фруктозных сиропов в год (менее 5% производимо-

го свекловичного сахара).

Ферменты и сахара

D-Фруктоза

D-Глюкоза

Сахароза

MR

180,16

MR

180,16

MR

342,30

Тпл

106 °С (Тразл.)

Тпл

146 °С (Тразл.)

Тпл

185–186 °С (Тразл. 165 °С)

Продукты углеводного обмена

Название

Относительная

Сырье, способ получения

сладость

(по сравнению

с сахарозой)*

Сахароза

1,00

Сахарная свекла и сахарный тростник

Глюкоза

0,5–0,8

Гидролиз крахмала, катализируемый α-амилазой,

глюкоамилазой

Глюкозный сироп

0,3–0,5

Гидролиз крахмала, катализируемый α-амилазой,

глюкоамилазой

Гидрированный

0,3–0,8

Гидрирование гидролизатов крахмала

глюкозный сироп

Изоглюкоза 42

0,8–0,9

Ферментативная изомеризация глюкозы

с глюкозоизомеразой

Фруктоза

1,1–1,7

• ферментативный гидролиз сахарозы

Инвертированный сахар

1,00

Гидролиз сахарозы с помощью инвертазы

Маннит

0,4–0,5

Гидрирование фруктозы

Сорбит

0,4–0,5

Гидрирование глюкозы

Ксилит

1,0

Гидрирование ксилозы

Лактит

0,3

Гидрирование лактозы

Мальтит

около 0,9

Гидрирование мальтозы

Палатинит, изомальт

0,45

Ферментативная изомеризация сахарозы с образованием

изомальтулозы (палатинозы), гидрирование смеси

глюкопиранозидсорбита и глюкопиранозидманнита

* Сладость оценивают на вкус по сравнению с 10% раствором сахарозы, поэтому этот показатель варьирует

Получение

Крахмал α-Амилаза,

D-Глюкоза

Глюкозо-

D-Глюкоза + D-фруктоза

Изоглюкоза

глюкоамилаза

изомераза

42–55% фруктозы

Хроматографические

методы

D-Фруктоза

Сахароза

Инвертаза

D-Глюкоза + D-фруктоза

Инвертированный

50% + 50%

сахар

Глюкозный

Изомеризация

Очистка

Изоглюкоза 42

сироп

55–65 °С, иммобилизованная

Активированный уголь, ионообмен-

42%

95–98%

глюкозоизомераза

ная хроматография, удаление воды

фруктозы

декстрозы

в колонном реакторе*

Отделение глюкозы

Изоглюкоза 55

* Каскад реакторов из нескольких колонн.

Колоночная хроматография,

55%

изомеризация

фруктозы

Фермент активен более 50 сут.

91

Ферменты

Утилизация целлюлозы и полиозы

применяются в пищевой промышленности при приго-

же из грибов Trichoderma reesei, Aspergillus niger,

ВВЕДЕНИЕ. Целлюлазы и гемицеллюлазы широко

ленные из бактерий Cellulomonas и Clostridium, а так-

товлении пюре из овощей и фруктов. Кроме того, эти

Humicola insolens. Получение целлюлаз в биореакто-

ферменты используются в целлюлозно-бумажной

ре проводится по стандартной методике выделения

промышленности. Некоторые моющие средства так-

внеклеточных ферментов. После отделения клеток и

же имеют в своем составе щелочные целлюлазы (с

осаждения белков ферментный препарат имеет по-

целью размягчения целлюлозных волокон хлопчато-

бочные активности, в частности гемицеллюлазную.

бумажных тканей). Активно изучается возможность

Для многих технологических процессов такие препа-

использования целлюлаз и гемицеллюлаз для утили-

раты имеют преимущество по сравнению с очищен-

зации биомассы: образующиеся глюкоза и ксилоза

ными ферментами. Производство гемицеллюлаз для

могут служить питательными веществами при фер-

переработки целлюлозы основано на использовании

ментации с помощью микроорганизмов, например,

белого плесневого гриба Тrichoderma reesei. Как пра-

интенсивно вырабатывающих этанол. Однако на пра-

вило, проводят поверхностную ферментацию или

ктике такая технология пока не применяется.

проточную ферментацию в биореакторе. В первом

ЦЕЛЛЮЛОЗА – основной компонент клеточной стенки

случае для обогащения фракции внеклеточных фер-

растений, самое распространенное в органическом

ментов осуществляют водную экстракцию коджи

мире соединение. Волокна целлюлозы представляют

(см. с. 6), а по окончании ферментации клетки отде-

собой линейную последовательность молекул D-глю-

ляют, а фермент извлекают из культуральной жидко-

козы (около 10 000), соединенных между собой

сти путем обработки этанолом.

β-1,4-гликозидной связью. Между линейными цепя-

ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗЫ. β-Глюканазы получают из Bacil-

ми образуются водородные связи. Комплекс из

lus subtilis, Penicillium emersonii, Aspergillus niger

10–100 молекул называется элементарной фибрил-

и других микроорганизмов, манназы и галактоманна-

лой, микрофибриллы состоят из 20–30 таких фиб-

зы – из Aspergillus niger и Trichoderma reesei по стан-

рилл.

дартной технологии выделения внеклеточных фер-

ПОЛИОЗЫ (ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗЫ) – группа короткоце-

ментов.

почечных гетерополимеров, построенных из пентоз,

ГЛЮКОЗА И КСИЛОЗА. Промышленные отходы, со-

гексоз, дезоксигексоз и гексуроновой кислоты. Кле-

держащие целлюлозу и полиозы (древесная стружка,

точная стенка растений на 20% состоит из гемицел-

багасса и др.), можно разлагать с образованием глю-

люлоз. В зависимости от состава гемицеллюлозы де-

козы и ксилозы, которые затем добавляют в пита-

лятся на три типа: ксилоглюканы, арабиногалактаны и

тельные среды для микробной ферментации. Эконо-

пентозаны. Ксилоглюкан (ксилан) построен из остат-

мические затраты на этот процесс складываются из

ков глюкозы, соединенных β-1,4-гликозидной свя-

расходов на транспортировку продукта, на подготовку

зью. Разветвления цепей ксилоглюканов образованы

субстрата, а также стоимости используемых фер-

за счет β-1,6-связей с остатками ксилозы. Ксило-

ментов. На первом этапе происходит разрушение

глюканы связываются с микрофибриллами целлюло-

лигнина термической обработкой или под действием

зы через водородные мостики. Роль арабиногалакта-

щелочи; при этом полиозы также частично

нов, состоящих из арабинозных и галактозных остат-

деградируют. Расходы на производство целлюлаз

ков, соединенных β-1,4-связями, заключается в

в рамках проекта США «Биомасса для этанола» в

образовании связей с гликопротеинами, входящими

2001 г. были снижены примерно на 80%.

в состав клеточной стенки. Пентозаны построены из

полимерных цепей арабинозы и ксилозы.

БИОДЕГРАДАЦИЯ. В природе разложение целлюло-

зы осуществляют бактерии и грибы. Среди послед-

них особая роль принадлежит белым плесневым

грибам, которые могут гидролизовать целлюлозу и

полиозы, одновременно окисляя лигнин. В сложной

реакции, в результате которой происходит разрых-

ление волокон целлюлозы, принимают участие мно-

жество ферментов. У некоторых организмов, напри-

мер клостридий, эти ферменты организованы в

целлюлосомы – белковые комплексы, находящиеся

на поверхности клеток.

92

ЦЕЛЛЮЛАЗЫ образуются во многих микроорганиз-

мах. Наиболее хорошо изучены целлюлазы, выде-

Ксило-

Микрофибриллы

глюкан

целлюлозы

Арабинан + галактан

Водо-

Арабино-

Участок, богатый

родные

гидроксипролином

мостики

галактуронан

Гликопротеин

Рамногалактуронан

Ксило-

глюкан

Микрофибриллы

Микрофибриллы целлюлозы

целлюлозы

Компонент

Состав

Степень

Состав

Содержание

полимеризации

в клеточной

стенке, %

Целлюлоза

β-1,4-D-Глюкоза

1000–10 000,

D-Глюкоза

Древесина – 60*,

микрофибриллы

хлопок – 90

Пектин

Полигалактуроновая кислота,

100–2000

Галактуроновая кислота, 10–40

рамногалактуронаты,

метиловые эфиры

галактаны, арабиногалактаны

галактуроновой кислоты,

рамноза, арабиноза

Полиозы

Ксиланы, ксилогликаны,

Ксилоза, глюкоза,

20

(гемицеллюлозы) β-1,3- и -1,4-D-глюканы,

галактоза, манноза

галактоманнаны

Другие

Арабиногалактаны,

Галактоза, арабиноза,

полисахариды

глюкурономаннаны

глюкуроновая кислота,

манноза

Культура

Поверхностная культура

Выделение

Выход

продукта

Рекомбинантный штамм-

Переработка коджи

Экстракция водой,

10 000 ед.

суперпродуцент Trichoderma reesei

3–5 сут

осаждение этанолом

за 100 ч

Ферменты

ВВЕДЕНИЕ. Целлюлоза – ценный материал, который

ры белого плесневого гриба Ophiostoma piliferum и

получают из древесины в результате удаления поли-

инкубируют в течение нескольких недель. Технология

оз и лигнина. Продукты переработки целлюлозы ис-

была отработана в масштабе около 100 тонн; в ре-

пользуются в целлюлозно-бумажной и химической

зультате крафт-процесс происходил со значительно

промышленности. В 2004 г. в мире было произведе-

большей эффективностью и качество продукта за-

но около 160 млн тонн целлюлозы и 330 млн тонн

метно повышалось по сравнению с традиционными

бумаги и картона, из них более половины – в северо-

методами.

американских странах на 1 тонну бумаги расходуется

ФЕРМЕНТЫ ДЛЯ ОТБЕЛИВАНИЯ БУМАГИ. Получен-

3,3 тонн древесины и 0,4 тонны нефти; сточные во-

ная в результате крафт-процесса или сульфитной об-

ды предприятий целлюлозно-бумажной промышлен-

работки целлюлозная масса легко поддается обра-

ности очень загрязнены: при производстве 1 тонны

ботке ферментами. Отбеливание массы с помощью

целлюлозы в сточные воды попадает 1 кг AOX и

ClO2 позволяет избавиться от нежелательных крася-

55 кг ХПК. Таким образом, современное целлюлоз-

щих компонентов. Предварительная обработка цел-

но-бумажное производство характеризуется высоки-

люлозной массы ксиланазами значительно повыша-

ми затратами энергии и сырья и загрязняет окружаю-

ет эффективнсть отбеливания: при этом снижается

щую среду. Поэтому ведется активная работа по

расход химикатов и улучшается качество отбелива-

поиску новых технологий в этой области. Свойства

ния. В 1992 г. в странах Северной Европы в эксплу-

конечного продукта – целлюлозы или бумаги – зави-

атацию были введены 10 целлюлозно-бумажных

сят от вида древесины, используемой в качестве сы-

комбинатов, на которых бумажная масса перед отбе-

рья, и способа переработки. Эвкалипт и тополь отно-

ливанием подвергалась обработке ксиланазами. Об-

сятся к твердым сортам древесины, они очень

щий объем производства составил около 1000 т/сут.

быстро растут, однако эта древесина плохо поддает-

Данный метод позволил сократить расход ClO2 на

ся обработке. Мягкая древесина (береза, сосна, ель)

5 кг/т массы. Цена фермента составила ~2 долл.

построена из более длинных волокон: она хорошо

США/т целлюлозы и заметной экономической прибы-

поддается обработке, однако годовой прирост этих

ли применение фермента не принесло, однако уро-

деревьев невелик. По сравнению с твердыми сорта-

вень загрязнения сточных вод снизился примерно на

ми мягкая древесина содержит меньше полиоз

треть. Среди множества изученных ксиланаз чаще

(14–17%), но больше лигнина (26–32%). Одной из

используются ферменты из Clostridium thermocellum

задач современных биотехнологических разработок в

и Streptomyces roseiscleroticus, а также рекомби-

области целлюлозно-бумажного производства явля-

нантный белок, ген которого выделен из термофиль-

ется снижение содержания лигнина в мягкой древе-

ного микроорганизма Thermotoga maritima и клони-

сине путем введения чужеродных генов или с помо-

рован в клетках Escherichia coli. Температурный

щью культур растительных клеток.

оптимум для этого фермента составляет около

ПРОИЗВОДСТВО ЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ МАССЫ. Целлюлоз-

95 °С. В настоящее время существуют коммерческие

ную массу получают механическим, термомеханиче-

препараты ферментов из Trichoderma longibrachiatum

ским или химическим способом после валки леса,

и T. reesei.

окорки и размельчения в древесную стружку. Чаще

КОНТРОЛЬ СМОЛООБРАЗОВАНИЯ. Некоторые сорта

всего используется химический способ, когда в усло-

древесины, например сосна, содержат повышенное

виях высокого давления при 170 °С лигнин деполи-

количество триглицеринов, которые в жестких усло-

меризуется под действием Na2S/NaOH. Этим мето-

виях получения целлюлозной массы вызывают осмо-

дом, получившим название крафт-процесса, в мире

ление. Использование липаз, выделенных из микро-

производится более 80% всей целлюлозы. Другой

организмов, позволяет бороться с этой проблемой.

метод – сульфитный, когда древесная стружка обра-

Кроме того, при отбеливании обработанной липазами

батывается избытком SO2. В основе новейших техно-

массы уменьшается образование хлорсодержащих

логий ферментативной деградации лигнина для про-

производных триглицеринов.

изводства целлюлозы и бумаги лежат естественные

УДАЛЕНИЕ ТИПОГРАФСКОЙ КРАСКИ. На одном из

процессы гниения.

этапов переработки бумажной макулатуры необходи-

ПРОЦЕССЫ ГНИЕНИЯ. В настоящее время ведутся ис-

мо удалить со старой бумаги печатную типографскую

следования возможностей использования микроор-

краску. Эту операцию значительно облегчает обра-

ганизмов, разрушающих лигнин, прежде всего,

ботка смесью ферментов, содержащей целлюлазы,

белых плесневых грибов для первичной обработки

ксиланазы и липазы.

древесины. Примером может служить процесс

94

Cartapip®, разработанный фирмой Clariant Со. Для

деградации лигнина в древесные стружки вносят спо-