Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Ферменты

ВВЕДЕНИЕ. Ферменты чрезвычайно широко исполь-

вавшихся из-за наличия примесей в ферментном пре-

зуются в промышленных технологиях, например в

парате, обходится дешевле, чем если бы проводилась

производстве стиральных порошков, пищевых проду-

дополнительная очистка исходного фермента. При

ктов, бумаги, текстиля и кожаных изделий. Многие

оценке применимости ферментного препарата в про-

реакции химического синтеза в промышленности

мышленном процессе учитывают не только его биохи-

также протекают с участием ферментов, так как по

мические характеристики, но и производственные

сравнению с традиционными катализаторами фер-

традиции. Поэтому при поиске ферментных препара-

менты обладают большей специфичностью. Кроме

тов с улучшенными качествами действуют особые

того, в настоящее время, когда многие ферменты до-

критерии, так что не всегда более активный препарат

ступны в виде рекомбинантных белков, их использо-

выигрывает при сравнении с уже известным ранее и

вание становится экономически выгодным, чем и

используемым аналогом.

объясняется стремительное развитие методов фер-

ПРОИЗВОДСТВО ФЕРМЕНТОВ. Производство приме-

ментативного анализа для диагностики и контроля

няемых в промышленности ферментов контролиру-

качества пищевых продуктов. Гены многих фермен-

ется согласно «Правилам организации производства

тов клонированы, а методы белковой инженерии по-

и контроля качества» (Good Manufacturing Practice).

зволяют оптимизировать свойства белков с целью их

Ферменты, полученные или модифицированные ме-

аналитического или промышленного применения.

тодами генетической инженерии, чаще всего идут на

Как правило, из-за высоких цен на кофакторы в про-

производство стиральных порошков. Для продуктов с

мышленности «работают» ферменты, не требующие

ограниченным потребительским спросом затраты на

кофакторов: гидролазы, лиазы, изомеразы и некото-

сертификацию часто превышают прибыль от продажи

рые оксидоредуктазы.

рекомбинантного продукта, поэтому случаи сертифи-

С КАКОЙ ЦЕЛЬЮ ПРИМЕНЯЮТСЯ ФЕРМЕНТЫ? Во

кации таких продуктов относительно редки. Одно из

всех отраслях промышленности, когда необходимо

исключений – рекомбинантный химозин – фермент,

повысить качество продукции и снизить затраты на

использующийся в производстве сыра.

производство, могут быть использованы ферменты.

ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. Экономический эффект

Протеазы в составе стирального порошка удаляют

использования ферментативной технологии зависит

белковые загрязнения с волокон тканей эффектив-

от цены фермента и рыночной цены продукта. Одна

нее, чем любые другие компоненты современных мо-

тонна неочищенного и достаточно чистого фермента

ющих средств. При ферментативном расщеплении

может стоить от нескольких центов до нескольких

крахмала образуется значительно меньше побочных

долларов. За последние 10 лет объем рынка фер-

продуктов, чем при проведении кислотного гидроли-

ментов вырос на 50% и составляет около 1,8 млрд

за. При изготовлении фруктовых соков использова-

доллларов США.

ние ферментов позволяет значительно увеличить эф-

фективность переработки фруктов. В кожевенной

промышленности действие протеаз и коллагеназ по-

могает освободить шкуру животного от волос и других

«излишеств»; использование ферментов позволило

значительно улучшить условия труда работников это-

го весьма экологически грязного производства. Тра-

диционно для створаживания молока использовали

сычужный фермент (экстракт из сычуга крупного ро-

гатого скота). В современном сыроварении «работа-

ет» рекомбинантный сычужный фермент, что значи-

тельно сокращает длительность процесса и улучшает

санитарногигиенические условия производства. В от-

личие от высокоспецифичных аналитических реак-

ций, во всех этих биотехнологических процессах при-

нимает участие множество сложных, зачастую

недостаточно полно охарактеризованных соединений.

Из экономических соображений в промышленных

процессах, как правило, используют почти неочищен-

ные ферментные препараты, обладающие рядом до-

82

полнительных активностей. Часто процедура очистки

основного продукта от побочных продуктов, образо-

Область применения

Фермент(ы)

Источник (некоторые),

Доля на рынке

Назначение

из которого выделен

ферментов,

фермента

фермент

%

Производство стиральных

Протеазы

Bacillus licheniformis

40

1

порошков

Липазы

Aspergillus nidulans

Целлюлазы

Trichoderma reesei

Расщепление крахмала

α-Амилаза

Bacillus amyloliquefaciens

5

3, 4

Изомеризация глюкозы

Глюкозоизомераза

Streptomyces venezuelae

7

1, 3

Пивоварение*

Амилазы

Bacillus subtilis

5

3, 4

Переработка овощей

Целлюлазы

Aspergillus niger

7

3, 4, 5, 6

и фруктов, виноделие

Гемицеллюлазы

Пектиназы

Хлебопечение

α-Амилаза

Aspergillus oryzae

10

1, 3

Протеазы

Производство сыров

Протеазы

Сычужный фермент,

12

2

Химозин

Rhizomucor miehei,

Липазы

Saccharomyces cerevisiae

Силосование

Целлюлазы

Aspergillus niger

2

3

и производство кормов

Производство бумаги

α-Амилаза

Bacillus amyloliquefaciens

2

4

и текстильная промышленность

Кожевенная промышленность

Протеазы

Aspergillus oryzae

10

1, 7

* В Германии не используется

%

Ферменты в различных отраслях промышленности

Стиральные порошки

Страны ЕС и Япония

40

США

30

HFS*

Хлебо-

Производ-

Кожевенное

Продукты

Разложение

20

печение

ство сыра

производ-

из фруктов

крахмала

10

ство

и виноделие

0

* HFS (high fructose syrup) – сироп с высоким содержанием фруктозы («изоглюкоза»)

Применение

Цена

С какой целью применяют ферменты?

Получение крахмального

~ 2 долл. США/т крахмала

1

Повышение выхода продукта

клейстера

Осахаривание

3,5 долл. США/т крахмала

2

Улучшение вкусовых качеств

Изомеризация

6 долл. США/т крахмала

Получение «изоглюкозы»

6–7 долл. США/т крахмала

3

Более продуктивная

в США (1986)

переработка

Получение спирта (1984)

1 долл. США/т крахмала

Пивоварение

10 цент./100 л спирта

Хлебопечение США

5–10 цент./100 кг муки

4

Снижение затрат

на производство

Европа

5–50 цент./100 кг муки

Изготовление

5–10 цент./100 л сока

фруктовых соков

5

Улучшение фильтруемости

Виноделие

5–10 цент./100 л вина

Изготовление лимонадов

26–79 цент./1000 л

Производство сыров

5 цент./100 л молока

6

Консервирование продукта

Производство

4–6 цент./кг

стиральных порошков

стирального порошка

7

Снижение количества

Кожевенное

1,2–3 долл. США/т кожи

экологически вредных отходов

производство

Ферменты

Ферменты в производстве моющих средств

первый стиральный порошок с добавлением панкреа-

цесса не превышает 72 ч. Затем клеточную массу от-

ВВЕДЕНИЕ. Около 100 лет назад Отто Рём создал

под контролем этих промоторов. Длительность про-

тических ферментов; это моющее средство хорошо

деляют в специальных сепараторах или отфильт-

удаляло с тканей загрязнения белковой природы

ровывают (чаще всего используется мембранная

(пятна крови, какао, травы и др.). В 1960-е гг. после

технология); протеиназы (внеклеточные ферменты)

разработки технологии получения щелочных протеаз

очищают и концентрируют осаждением или ультра-

из штаммов Bacillus производство стиральных по-

фильтрацией. При попадании в дыхательные пути

рошков стало стремительно развиваться. Методами

протеиназы могут вызывать аллергические реакции,

белковой инженерии эти протеазы были усовершен-

поэтому их добавляют в стиральные порошки в виде

ствованы специально для использования в моющих

гранул. Для этого к концентрату фермента в высоко-

средствах. Мировое производство рекомбинантных

скоростном смесителе и экструдере добавляют соли,

протеаз из Bacillus превышает 1000 тонн в год. В со-

воск, стабилизаторы; при сушке в кипящем слое об-

став стиральных порошков и моющих средств для

разуются гранулы («капсулы»), покрытые воском и

посудомоечных машин могут входить и ферменты

пигментом. Согласно исследованиям, протеазы в та-

других классов – целлюлазы, липазы, амилазы, ге-

кой форме безопасны для здоровья и не вызывают

мицеллюлазы, манназы, пектат-лиазы, протеазы и

аллергических реакций.

амилазы.

ЦЕЛЛЮЛАЗЫ. При определенных рН целлюлазы

УДАЛЕНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ СТИРАЛЬ-

эндодействия катализируют гидролиз целлюлозы

НЫХ ПОРОШКОВ. Стиральные порошки содержат, как

хлопчатобумажных тканей. В результате ткань стано-

правило, анионные и неионные, а в некоторых случа-

вится более мягкой, а краски более яркими. Кроме

ях и катионные поверхностно-активные вещества

того, целлюлазы эффективны при удалении различ-

(ПАВ). В жесткой воде из-за взаимодейстия с иона-

ных пятен. В стиральные порошки добавляют цел-

ми Ca2+ и Mg2+ анионные ПАВ теряют активность и

люлазы из клеток Humicola insolens, Bacillus sp.,

выпадают в осадок, поэтому к стиральным порошкам

Melanocorpus sp. и Thielavia sp., клонированных в As-

добавляют смягчители, понижающие жесткость во-

pergillus oryzae или Bacillus subtilis.

ды. Ранее для смягчения воды использовался фос-

ЛИПАЗЫ. Эффективность липаз связана с тем, что,

фат натрия, а сейчас – натрий–алюминиевые соли

кроме расщепления триглицеринов, эти ферменты

кремниевой кислоты (силикаты), а также в неболь-

катализируют расщепление эфиров длинноцепочеч-

ших количествах органические лиганды-комплексо-

ных кислот, присутствующих в таких трудноудаляе-

образователи (лимонная кислота и фосфонат). В ка-

мых загрязнениях, как следы от губной помады.

честве отбеливателей добавляются перкарбонат

Чаще всего в стиральные порошки добавляют липазы

натрия и активаторы (например, тетраацетилэтилен-

из клеток Humicola insolens или рекомбинантных

диамин, ТАЭД) – при стирке образуются органиче-

штаммов Aspergillus oryzae.

ские пероксикислоты. Раствор стирального порошка

АМИЛАЗЫ. Амилазы удаляют крахмалсодержащие

имеет рН ~10,0, процесс стирки, как правило, зани-

загрязнения. В некоторые стиральные порошки и мо-

мает 30 мин при температуре от 30 до 90 °С, следо-

ющие средства добавляют термостабильные амила-

вательно, входящие в состав стирального порошка

зы, устойчивые в щелочных условиях. Их получают

ферменты должны быть устойчивы в щелочных усло-

из рекомбинантных штаммов Bacillus, в которых в ге-

виях и при повышенной температуре (вплоть до

не амилазы произведена замена некоторых остатков

60 °C), а также быть достаточно устойчивыми к дей-

метионина.

ствию комплексообразователей, окислителей и ПАВ.

Ферменты, входящие в состав стиральных порошков,

имеют низкую специфичность.

ПРОТЕАЗЫ. В стиральных порошках и моющих сред-

ствах используются исключительно сериновые про-

теиназы (субтилизины), выделенные из штаммов Ba-

cillus. Сегодня методами генетической инженерии

получены штаммы-суперпродуценты протеиназ. Пу-

тем направленного мутагенеза удалось получить про-

теиназы, устойчивые к действию комплексообразо-

вателей и окислителей. В ходе ферментации на

определенной стадии клеточного роста в среду доба-

84

вляют промотор-специфические индукторы, стимули-

рующие синтез протеиназ, гены которых находятся