Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Специальные продукты

70

Биотрансформация

ВВЕДЕНИЕ. Биотрансформация – основная функция организма, необходимая для осуществления нормального обмена веществ и обезвреживания токсичных веществ, в том числе ксенобиотиков. В биотехнологии под термином биотрансформация принято понимать биокатализ, то есть процесс ферментативного превращения природного или синтетического вещества-предшественника в продукт с необходимыми свойствами. Этот процесс может осуществляться в биореакторах микроорганизмами, целыми клетками животных или растений, их отдельными органеллами, а также иммобилизованными на носителях ферментами или клетками. В последние годы сильно выросла роль генетической инженерии для усовершенствования ферментов и получения рекомбинантных организмов. Термины «биокатализ», «ферментация» и «биотрансформация» в определенном смысле можно считать синонимами. Процесс биотрансформации включает одну или несколько стадий – каждую стадию катализирует отдельный фермент. Применение выделенных ферментов имеет ряд преимуществ: можно оптимизировать температурный режим проведения реакции, так как белок менее чувствителен к условиям среды, чем более сложные биологические системы (органеллы или клетки); отсутствует необходимость поддерживать стерильные условия реакции; фермент взаимодействует с субстратом более эффективно. Использование органелл или целых клеток более целесообразно в тех случаях, когда выделение фермента является сложной процедурой, если очищенный фермент нестабилен или процесс трансформации включает несколько стадий и все необходимые ферменты находятся в клетке.

МИКРООРГАНИЗМЫ используются как для получения природных метаболитов (например, глу-тами- новой кислоты), так и для превращения веществ, которые не являются их природными субстратами (к примеру, гидроксилирование стероидов по 11β-по- ложению). Как правило, ферменты катализируют реакции нормального метаболизма с высокой субстратной специфичностью. Экспрессия генов или целых генных кластеров, клонированных из другого организма, позволяет расширить круг веществ, подвергающихся биотрансформации, как, к примеру, в случае получения индиго. Метаболическая инженерия и белковый дизайн позволяют находить новые метаболические пути на основе анализа генома и играют важную роль при разработке методов промышленной биотрансформации.

ЖИВОТНЫЕ КЛЕТКИ широко используются для синтеза фармацевтических препаратов и антител в биореакторах. В настоящее время проводятся работы по созданию искусственной печени для очищения крови от некоторых токсических веществ. Токсины, выделен-

ные из крови при диализе, в результате биотрансформации осаждаются на молекулах альбумина.

РАСТИТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ. Наиболее известный пример использования растительных клеток для биотрансформации – реакции специфического гидроксилирования. Так, в культуре Digitalis lanata в результате гидроксилирования дигитоксина по положению 12 образуется дигоксин. Биореакторы для культивирования растительных клеток по техническим причинам пригодны лишь для ограниченного числа процессов, например для синтеза таксола (PaclitaxelTM) Taxus brevifolia.

ОТДЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ целесообразно применять, если реакция биотрансформации проходит всего в одну стадию и может протекать в системе in vitro. В большинстве случаев в промышленности используются не требующие кофакторов ферменты, например, для реакций субстрат-специфичного гидролиза или этерификации. В последнее время изолированные ферменты также стали применяться для осуществления реакций присоединения по двойной связи, например в карбонильных группах.

«РЕКОМБИНАНТНЫЕ» ПУТИ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ. Наиболее яркими примерами использования этого подхода в промышленности является производство аскорбиновой кислоты в Erwinia herbicola (см. ранее)

иполучение индиго в рекомбинантных клетках Escherichia coli. Методами генетической инженерии в клетках E. coli была дополнительно усилена активность триптофаназы, катализирующей реакцию превращения триптофана в индол, а затем с помощью TOL-плазмиды в клетки был введен ген нафталиндиоксигеназы из Pseudomonas sp. Полученный рекомбинантный штамм обладает способностью синтезировать индиго – один из самых распространенных красителей для тканей. Для получения L- или D-аминокислоты из синтетических гидантоинов используют хозяйские клетки E. coli с векторными кассетами, содержащими рекомбинантные гидантоиназы

икарбамилазы («синтетическая биология»).

Специальные продукты

72

Биотрансформация стероидов

однако пока эти методы экономически невыгодны.

ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ 11β-АТОМА. Гидроксилирование – одна из важнейших стадий синтеза стероидов с заданной структурой. В настоящее время получены обширные коллекции микроорганизмов, в каждом из которых гидроксилирование протекает по определенному положению, что позволяет осуществлять гидроксилирование предшественников стероидов по всем возможным положениям. Важным примером про-

эти посторонние активности часто не влияют на производственный процесс. Для диагностических, аналитических и терапевтических целей чаще используют внутриклеточные ферменты, и в этом случае необходимы препараты ферментов с высокой степенью очистки. После разрушения клеток клеточный дебрис удаляют центрифугированием, а внутриклеточное содержимое концентрируют. Затем для удаления посторонних белков последовательно проводят несколько стадий хроматографического разделения компонентов полученного раствора. Степень очистки фермента определяют по следующим критериям: 1) удельная активность фермента; 2) активность других компонентов препарата; 3) электрофоретическая картина разделения компонентов препарата. Многие ферменты, использующиеся в промышленности, получены путем ферментации в рекомбинантных штаммах микроорганизмов. Методы генетической инженерии позволяют получать продукт с меньшим числом побочных активностей, следовательно, его очистка требует значительно меньших затрат.

РАЗРЕШЕНИЕ НА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ. Ферменты являются природными белками, поэтому их использование во всех областях, за исключением пищевой промышленности или медицины, не требует специальных разрешений. Компоненты пищевых продуктов, полученные из природного сырья с помощью ферментов (например, изоглюкоза), относятся к «природным» и применяются наравне с естественными. В соответствии с постановлениями Международной ассоциации производителей ферментов для пищевой промышленности (AMFEP), при производстве продуктов питания разрешено использование ферментов животного и растительного происхождения, а также продуктов так называемых «безопасных» микробных штаммов. Применение ферментов, выделенных из других микроорганизмов, разрешается лишь после прохождения многочисленных и весьма дорогостоящих процедур тестирования и утверждения, поэтому использование таких ферментов в промышленных масштабах оказывается экономически невыгодным.