Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Загрязнение участка прибрежной отмели площадью 2 м2 нефтью

10 × загрязнение 1 литром нефти

10 × загрязнение 1 литром нефти; с добавлением трегалозодикориномиколата в концентрации 1 г/л;

10 × загрязнение 1 литром нефти; с добавлением неионных детергентов

в концентрации 100 мл/л (диспергирует лучше, но затрудняет деградацию)

Специальные продукты

66

Микробные полисахариды

ВВЕДЕНИЕ. Растительные полисахариды (крахмал, целлюлоза, гуммиарабик, гуаровая смола, пектин, альгинаты, агар и др.) и их полусинтетические производные играют важную роль в современных технологиях, в том числе в качестве загустителей в пищевой промышленности или при заводнении нефтяных скважин. Производство полисахаридов растительного происхождения достигает нескольких десятков тысяч тонн в год. Внеклеточные микробные полисахариды также могли бы найти применение в самых разнообразных отраслях промышленности, однако из-за значительных производственных затрат их использование пока ограничено. Наибольшее значение имеют ксантан и декстран. Гиалуроновая кислота уже применяется в биокосметике.

КСАНТАН представляет собой разветвленный гетерополисахарид, состоит из пяти остатков гексоз (глюкозы, маннозы и глюкуроновой кислоты). Молекулярная масса ксантанов – от 2 до 12 тыс. кДа. Ксантановые смолы имеют высокую вязкость (в зависимости от числа групп пирувата в полимере) и по ряду свойств сходны с пластмассой. Эти вещества безвредны для человека, поэтому их добавляют в качестве стабилизаторов и загустителей во многие пищевые продукты. Кроме того, благодаря устойчивости в растворах электролитов ксантаны добавляют к буровому шламу при бурении нефтяных скважин. Ксантаны образуются в клетках Xanthomonas campestris при аэробном росте на среде с глюкозой. Получение ксантанов осуществляют, как правило, в процессе периодической ферментации, используя в качестве источника углерода глюкозу, а в качестве источника азота – пептон, нитрат аммония и мочевину. Клонирование генов β-галактозидазы (lacZ) и лактопермеазы (lacY) из Escherichia coli в геном X. сampestris позволило получить штамм, использующий в качестве источника углерода молочную сыворотку (отходы молочной промышленности). Из-за образования ксантанов культуральная жидкость становится очень вязкой (до 10 000 сантипуаз). Для сохранения аэробных условий роста в этом случае особое значение имеют мешалки специальной конструкции. Как правило, ксантаны из среды осаждают растворителем – изопропанолом. В современной промышленности производство ксантанов достигает 30 000 т/год. ДЕКСТРАНЫ – очень важные вещества, которые могут служить заменителями плазмы крови. Благодаря тому, что полимерные цепи в этих веществах имеют поперечные сшивки, образуются сетчатые структуры, которые очень эффектны при очистке белков разного размера. Декстраны также применяются в пищевой промышленности. Разветвленные цепи декстранов, состоящие только из остатков глюкозы, связанных между собой α-1,6-связями, имеют моле-

кулярную массу ~5 107 Да. У дрожжей и некоторых бактерий декстраны играют роль резервных полисахаридов. В качестве примера продуцента декстрана можно назвать Streptococcus mutans, бактерию, которая обитает в кариозной полости зуба человека. Образование декстрана приводит к появлению бактериального налета («камней»). Для промышленного получения декстрана используют Leuconostoc mesenteroides: в течение 24 ч в клетках этого микроорганизма из сахарозы образуется до 500 г/л декстрана. Декстран выделяют из культуральной жидкости осаждением этанолом, затем гидролизуют кислотой и еще раз осаждают этанолом. Декстран с молекулярной массой 75 000 Да используют как заменитель плазмы крови, а с молекулярной массой 40 000 Да – в качестве антитромболитика при полостных операциях.

ДРУГИЕ МИКРОБНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ. Pseudomonas aeruginosa и Azotobacter vinelandii синтезируют альгинаты, по строению аналогичные альгинатам из водорослей. Альгинаты часто используют в качестве носителей для иммобилизации клеток при проведении различных биокаталитических реакций. Некоторые базидиомицеты синтезируют полимер склероглюкан, главная цепь которого образована остатками глюкозы, соединенными β-1,3-связями, а в местах разветвления остатки глюкозы присоединены β-1,6- связями. Склероглюкан, как и геллан, образующийся в клетках Auromonas elodea, используется как пищевая добавка. Пуллулан – глюкан с разветвленной цепью, в которой остатки глюкозы соединены α-1,4- (90%) и α-1,6- (10%) связями. Из пуллулана изготовляются тонкие пленки, не пропускающие кислород, которые используются для защиты пищевых и других продуктов от окисления. Промышленное получение микробных полисахаридов пока является очень дорогостоящим и экономически невыгодным процессом, поэтому такие полимеры еще не нашли широкого применения в современных технологиях.

ными белками, гены которых удалось клонировать и модифицировать для экспрессии в клетках E. coli и Pichia pastoris. Выход рекомбинантных белков фиброина и спидроина составляет около 1 г/л.

БЕЛКИ С АДГЕЗИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ. Мидии Mytilus edulis обладают способностью прикрепляться к раковинам ракообразных или поверхности обшивки кораблей

итаким образом перемещаться на большие расстояния. Эти моллюски синтезируют специфический белок, проявляющий адгезионные свойства. Белок-предшествен- ник имеет молекулярную массу 130 кДа и состоит преимущественно из полярных аминокислот – тирозина, серина, треонина, лизина и пролина. В ходе посттрансляционных модификаций остатки тирозина и пролина преобразуются в о-гидрокситирозин или 3- или 4-гидро- кси-L-пролин соответственно. На воздухе полипептиптидные цепи полимеризуются, и образуются дихиноны. Методами генетической инженерии удалось осуществить гетерологичную экспрессию фрагмента белка адгезии размером 25 кДа в клетках E. coli с достаточно высоким выходом. Однако в этих клетках-хозяевах не происходит посттрансляционных модификаций белков, поэтому выделенный рекомбинантный продукт обрабатывают ферментом тирозиназой, который гидролизует остатки тирозина до о-гидрокситирозина, что обеспечивает образование поперечных сшивок между полипептидными цепями. Полученный белок используют в медицинских целях, в том числе в стоматологии для заполнения полостей в зубе.

БАКТЕРИОРОДОПСИН. Галобактерия Halobacterium salinarum обитает в средах с повышенным содержанием поваренной соли: концентрация NaCl 3–5 М является нормальной для ее роста. При фототрофном росте бактериородопсин служит в качестве протонного насоса

итаким образом снабжает клетку энергией. Молекулы бактериородопсина формируют в клеточной мембране агрегаты (бляшки), которые легко выделяются в составе так называемой «пурпурной мембраны», на 75% по массе состоящей из белков и на 25% из липидов. Препараты «пурпурных мембран» очень стабильны. Кофактор бактериородопсина ретиналь и процесс его цис-транс- изомеризации связан с необычной функцией: бактериородопсин действует как светозависимый протонный насос, число оборотов которого может достигать 100 в секунду. В восстановленной форме бактериоро-

допсин имеет пурпурный цвет (λmax = 570 нм), а при протонировании ретиналя и остатка лизина в положе-

нии 216 становится желтым (λmax = 410нм). Замена определенных аминокислотных остатков путем направленного мутагенеза дает возможность регулировать скорость циклического светозависимого изменения цвета бактериородопсина. Чрезвычайно перспективным представляется использование бактериородопсина и его производных в качестве оптического носителя информации (фотоэлемента).