Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

ЕС-номер

Название, функция

Кофактор

Примеры

1.x.y.z

Оксидоредуктазы

1.1.y.z

Действуют на СН–ОН-группу

NAD+, NADP+, PQQ

Алкогольдегидрогеназа

1.1.3.z

Действуют на СН–ОН-группу

FAD+

Глюкозооксидаза

1.3.y.z

Действуют на С–Н-группу

Гем, Fe2+

Стероид-11β-гидроксилаза

2.x.y.z

Трансферазы

2.4.y.z

Переносят гликозильные группы

Гликозилтрансфераза

2.6.1.z

Переносят NH2-группы на С=О

Пиридоксальфосфат

Трансаминаза

3.x.y.z

Гидролазы

3.1.y.z

Гидролизуют эфирные связи

Липазы, эстеразы

3.2.y.z

Гидролизуют гликозидные связи

α-Амилаза

3.4.y.z

Гидролизуют пептидные связи

Субтилизин, трипсин

4.x.y.z

Лиазы

Катализируют реакции присоединения по двойным связям

4.x.y.z

Добавление (удаление) NH2-группы к (от) двойной связи

Аспартаза

5.x.y.z

Изомеразы

5.1.y.z

Рацемизация D- и L-аминокислот

Аланинрацемаза

5.3.y.z

Внутримолекулярные оксидоредуктазы

Ксилозо(глюкозо)-изомераза

6.x.y.z

Лигазы

6.2.y.z

Образование C–S связей

ATФ, КоА-SH

Ацетил-КоА-синтетаза

Получение ферментов

Микро-

Ферментация

организмы

Высушивание

Техни-

в псевдо-

ческие

ожиженном слое

фер-

Выделение

гранулирование

менты

Клонирование

Растительный

из клеток

Концент-

и экспрессия

материал

отделение

рирование

твердых частиц

Аналити-

Животный

Тонкая очистка

ческие

фер-

материал

менты

Применение

Источник

Примеры

Применение

Животные ткани

Панкреатические ферменты,

в соответствии с GMP*

сычужный фермент, пепсин

Растительные ткани

Папаин, бромелаин

в соответствии с GMP*

Микроорганизмы:

а) традиционно исполь-

Bacillus subtilis, Aspergillus niger и A. oryzae,

GRAS (generally recognized as safe) –

зуемые для получения

Mucor javanicus, Rhizopus sp., Saccharomyces

признаны безопасными в соответствии

продуктов питания

cerevisiae, Kluyveromyces fragilis и K. lactis,

с положениями AMFEP (Международная

Leuconostoc oenus

ассоциация производителей ферментов

для пищевой промышленности)

б) ферменты

Bacillus stearothermophilus, B. licheniformis,

Специальная процедура

хорошо изученных

B. coagulans, B. megaterium и B. circulans,

согласования

микроорганизмов

Klebsiella aerogenes

* GMP (good manufacturing practice) – «Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств»,

принятые Всемирной организацией здравоохранения. — Прим. перев.

75

Ферменты в химическом синтезе

1

4

Преимущества ферментов в реакциях химического синтеза

1

Стерео- и субстрат-специфичное окисление

2

неактивированных С–Н групп

Стереоселективные реакции присоединения

2

3

по активированным двойным связям

3

Стереоселективное восстановление

4

карбонильных групп

5

6

7

Стереоселективное восстановление

5

гидроксильных групп

Субстрат-специфичное замещение

6

в ароматических соединениях

Субстрат-специфичная изомеризация

7 Субстрат-специфичные и стереоселективные реакции

гидролиза и этерификации

Ферменты в биокатализе

Пероксидазы

1

2

4

5

Лиазы,

1

Оксидо-

и оксигеназы

редуктазы

трансферазы,

В том числе:

изомеразы

2

Трансферазы

Oчищенные

1

ферменты

3

Гидролазы

3

Липазы

Оксидоредуктазы

1

4

Лиазы

(целые клетки)

5

Изомеразы

Другие гидролазы

Эстеразы

3

3

6

Лигазы

Нитрилазы

3

3

Протеазы

Реакция

Фермент

Ежегодное

Фирма-

потребление, т

производитель

Расщепление пенициллина G

Пенициллинамидаза*

40 000

North China

3

с образованием

из E. coli

Pharmaceuticals

6-аминопенициллановой кислоты

Расщепление рацемата N-ацил-

Ацилаза*

5 000

Tanabe Sejyaku,

3

DL-аминокислот с образованием

из Aspergillus sp.

Degussa, DSM

L-аминокислот

Обработка NH3

Аспартаза* из E.coli

10 000

Tanabe Sejyaku

4

фумаровой кислоты с образованием

L-аспарагиновой кислоты

Гидролиз крахмала до D-мальтозы

α-Амилаза,

100 000

Различные фирмы

3

и D-глюкозы

глюкоамилаза

Изомеризация D-глюкозы в D-фруктозу Глюкозоизомераза*

100 000

Clinton Corn

5

из Streptomyces sp.

Products

Синтез акриламида из акрилонитрила

Нитрилгидратаза*

30 000

Nitto Chemicals

3

из Pseudomonas

chloraphis

Расщепление рацемата

Липаза* из

10 000

BASF

3

фенилэтиламинов

Pseudomonas cepacia

Трансэтерификация пальмового масла

Липаза* из

1000

Unilever

3

и метилового эфира стеариновой

Rhizomucor miehei

кислоты с образованием масла какао

Дегалогенирование

Дегалогеназа* из

Технология

Dow Chemicals

3

1-хлорпропандиола

термофильных

разрабатывается

Ферменты

Ферменты в клинических анализах

роль играют лабораторные анализы, где широко при-

этом анализируют не конечные продукты реакции, а

ВВЕДЕНИЕ. При клинической диагностике важную

метод определения глюкозы – кинетический. При

меняются ферменты различных классов. При этом

измеряют начальную скорость реакции (метод на-

используется свойство фермента специфически ка-

чальных скоростей). Когда концентрация субстрата

тализировать реакцию, в которой участвует лишь

значительно ниже Km (менее 1/10), скорость реак-

один компонент сложной среды. Чтобы получить пра-

ции линейно зависит от концентрации субстрата. При

вильный результат анализа, в ферментном препара-

таком методе анализа особенно важно соблюдать по-

те должны отсутствовать другие активности; поэтому

стоянные условия реакции, поэтому этот метод ле-

к степени очистки ферментов, применяемых при про-

жит в основе действия автоматических анализато-

ведении

клинических анализов, предъявляются

ров. Каталитический метод анализа основан на том,

очень жесткие требования. Анализы большого числа

что количество анализируемого вещества является

проб проводят с помощью лабораторных автомати-

лимитирующим фактором в циклическом каталити-

ческих анализаторов, тест-полосок или биосенсоров.

ческом процессе, в котором оно разлагается в ходе

Ферменты также применяются в качестве репортер-

одной ферментативной реакции и образуется в ходе

ных соединений (маркеров) в реакциях специфиче-

другой. Количество анализируемого вещества опреде-

ского связывания антител или нуклеиновых кислот

ляют по изменению количества одного из участников

(иммунный или ДНК-анализ): в присутствии избытка

циклического процесса. Так определяют, например,

субстрата ферменты значительно увеличивают ин-

концентрацию КоА в сопряженных реакциях, катали-

тенсивность сигнала. Объем рынка ферментов, ис-

зируемых фосфотрансацетилазой, цитратсинтазой и

пользуемых в целях медицинской диагностики, со-

малатдегидрогеназой.

ставляет около 6 млрд долл. США в год.

ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА. Объемы производства

МЕТОДЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ. В ферментативном ана-

ферментов, используемых в медицине при проведе-

лизе чаще всего используются фотометрические,

нии лабораторных анализов, невелики, однако эти

флуорометрические или люминометрические мето-

препараты ферментов должны иметь очень высокую

ды регистрации продукта реакции. Если продукт реак-

чистоту. Обычно это внутриклеточные белки, кото-

ции нельзя определять непосредственно, используют

рые образуются в клетке в малых количествах, поэ-

дополнительные ферменты, так называемую сопря-

тому для их выделения и очистки используют специ-

женную систему ферментативных реакций, продукты

альные методы. К настоящему времени получено

которых можно зрегистрировать. Например, в гидро-

много рекомбинантных штаммов-суперпродуцентов.

ксилазной реакции за восстановлением NAD(P)H

Методами генетической инженерии в ген фермента

можно наблюдать на длинах волн 334, 340 или

могут быть внесены изменения, и такой белок будет

366 нм. Современные спектрофотометры позволяют

обладать свойствами, оптимальными для своего вы-

проводить измерения в очень малых объемах образ-

деления и применения. Наряду с чистотой и высокой

ца (несколько микролитров).

специфичностью фермент должен оставаться актив-

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕН-

ным в течение достаточно продолжительного вре-

ТРАЦИИ. Ферментативные методы делятся на сле-

мени, поэтому в препарат добавляют различные ста-

дующие:

билизаторы, благодаря чему при хранении при тем-

а) метод конечной точки титрования;

пературе до +40 °С ферменты теряют менее 20%

б) кинетический метод;

активности в год.

в) метод ферментативного катализа.

Конечная точка титрования дает возможность опре-

деления количества субстрата или косубстрата,

которое полностью превратилось в продукт. Так с по-

мощью алкогольдегидрогеназной реакции опреде-

ляют содержание спирта, а с помощью лактатгидро-

геназной – лактата. Такой анализ выполняется всего

за несколько минут. Окончание реакции (конечная

точка) достигается тем быстрее, чем меньше Km или

чем больше Vmax, т. е. пока концентрация субстрата

самая высокая. Примером определения концентра-

ции субстрата по продукту сопряженной реакции

является

ферментативное определение глюкозы

78

с помощью гексокиназы и глюкозо-6-фосфат-

дегидрогеназы. Другой, значительно более быстрый

Ферменты, применяемые при проведении лабораторных клинических анализов

Фермент

ЕС-номер

Анализируемое вещество

Детектируемое

вещество

Алкогольдегидрогеназа

1.1.1.1.

Этанол, другие спирты, альдегиды

NADH

Глюкозооксидаза

1.1.3.4.

Глюкоза

Окраска

Пируваткиназа

2.7.1.40

Фосфоенолпируват, АДФ

Креатинкиназа

3.5.3.3.

Креатинин

Цитратлиаза

4.1.2.6.

Лимонная кислота

NAD+

Маннозо-6-фосфатизомераза

5.3.1.8.

Манноза

Сукцинил-КоА-синтетаза

6.2.1.4.

Сукцинат

Методы детектирования

Метод

Чувствительность

Определение концентрации NADH

1,2

метода, ммоль/л

Фотометрический

10–6–10–5

Поглощение

1,0

Флуорометрический

0,4

– по продукту реакции

0,8

– кинетический

10–7–10–6

0,6

– каталитический

10–9–10–8

– по продукту реакции

10–9–10–8

0,315

0,2

– каталитический

10–15–10–14

0

Люминометрический

10–13–10–8

260

300

340

400

Длина волны, нм

Определение концентрации субстрата по количеству продукта реакции

а

Алкоголь-

дегидрогеназа

Прямое определение

Этанол

Ацетальдегид +

NADH

+ H+

+ NAD+

продукта

Лактат-

или NADH

Лактат

дегидрогеназа

Пируват +

NADH

+ H+

+ NAD+

б

Гексокиназа

Глюкоза

+ ATФ

Глюкозо-6-фосфат + AДФ

Определение количества

Глюкозо-6-фосфат-

продукта реакции

Глюкозо-6-фосфат

+

NADP+ +

дегидрогеназа

в сопряженных реакциях:

H O

с высокоспецифичной

Определяемое

2

глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой

и с менее специфичной

соединение (аналит)

6-Фосфоглюконат

+

NADPH

+ H+

гексокиназой

Вещество, концентрацию

которого можно измерить

Кинетический метод

Кинетический метод определения глюкозы с использованием

Количество фермента и Km

гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы NADPH

Аналит

Фермент

Km,

v/Km,

через 10 с после добавления фермента в анализатор

с

0,6

моль/л

МЕ/л*

/10

0,4

АДФ

Аденилаткиназа

1,6 ∙ 10–3

1600

340

0,2

Глюкоза

Гексокиназа

1,0 ∙ 10–4

100

Глицерин

Глицеринкиназа

5,0 ∙ 10–5

50

A

0,0

20

40

60

Мочевая

Уратоксидаза

1,7 ∙

10–5

17

0

кислота

Глюкоза, ммоль/л

Фумаровая Фумараза

1,7 ∙

10–6

1,7

Уравнение Михаэлиса–Ментен:

кислота

v = vmax × [S]/(Km + [S])

Чем выше Km, тем больше фермента необходимо

При концентрации субстрата [S], когда [S]<< Кm

(Кm – константа Михаэлиса, характеризует сродство

добавить к пробе, для того чтобы за несколько

минут в продукт превратилось 99% субстрата.

фермента к субстрату), скорость v ферментативной

реакции прямо пропорциональна концентрации

субстрата [S].

79