Протокол № 15 Бактериологическое исследование крови больного с подозрением на
сепсис (предположительно стрептококковой этиологии)
1 этап исследования
У больного с подозрением на сепсис через 2 часа после подъема температуры до начала антибиотикотерапии с соблюдением правил асептики отобрали исследуемый материал - две пробы крови из двух локтевых вен. Для этого участок кожи над пунктируемой веной обработали тампоном, смоченным в 70% спирте, затем другим тампоном, смоченным 2% раствором йода. Забор крови из вены производили в объеме 10 мл одноразовым шприцем над пламенем спиртовки с последующим посевом непосредственно у постели больного во флаконы со 100 мл питательных сред, приготовленных
влаборатории:
-сахарным бульоном (для выделения аэробов и факультативных анаэробов);
-тиогликолевой средой (для выделения анаэробов).
Дополнительно использовали среду Сабуро (для выделения грибов). Доставку материала в лабораторию осуществляли при комнатной температуре в течение 1-2 часов.
Емкости с засеянной кровью поместили в термостат при +370С и просматривали ежедневно до появления признаков роста (максимальный срок наблюдения — 9-10 дней).
Параллельно с посевом произвели микроскопическое исследование крови путем приготовления двух мазков по типу «толстой капли»: каплю крови растирали в центре предметного стекла по диаметру приблизительно 2 см, высушивали, один мазок фиксировали и окрашивали по Граму, другой не фиксировали и аккуратно окрашивали метиленовым синим 2-3 мин.
Микроскопировали под иммерсионным увеличением. Обнаружили небольшое количество грамположительных кокков, расположенных в виде цепочек.
2 этап исследования
На сахарном бульоне и тиогликолевой среде - рост в виде осадка. В мазках - Грам+ кокки, расположенные цепочками.
Из всех положительных проб сделали пересев на сектора кровяного агара (КА).
КА помещали в термостат при +370С на 1-2 суток.
3 этап исследования
На пластинке КА отмечали рост большого количества однотипных мелких нежных полупрозрачных колоний с ровными краями, сероватым оттенком, окруженных обширными зонами прозрачного β-гемолиза.
В мазках - Грам+ кокки, расположенные цепочками.
Произвели постановку тестов для родовой и видовой идентификации стрептококков:
1)тесты Шермена (на толерантность) - рост в сахарном бульоне при +100С и +450С, рост в солевом бульоне с 6,5% NaCl, в щелочном бульоне при рН 9,6, в 40%-м желчном бульоне, на молоке с метиленовой синью.
2)биохимические тесты (окисление маннита, реакция Фогеса-Проскауэра)
Для определения серологической группы по Ленсфильду произвели постановку реакции латекс-агглютинации. Выделенная культура относится к серогруппе В.
Определяли чувствительность выделенной культуры стрептококков к антибиотикам диско-диффузионным методом по стандартной методике.
4 этап исследования
Произвели учет дифференциальных тестов. В сахарном бульоне при +100С и +450С, в солевом бульоне с 6,5% NaCl, в щелочном бульоне при рН 9,6, в 40%-м желчном бульоне, на молоке с метиленовой синью рост отсутствует.
Реакция Фогеса-Проскауэра - положительная.
Заключение
На основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных свойств считаем, что из крови больного выделена культура Streptococcus agalactiae.
Протокол № 16 Бактериологическое исследование носоглоточной слизи больного с
подозрением на назофарингит менингококковой этиологии
1 этап исследования
У больного с подозрением на назофарингит менингококковой этиологии взяли слизь с задней стенки глотки натощак стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке с обязательным надавливанием шпателем на корень языка. Тампон ввели концом кверху за мягкое небо в носоглотку, провели 2-3 раза по задней стенке и извлекли, не касаясь зубов, слизистой щек, языка.
Тампон опустили в пробирку с транспортной средой и доставили в лабораторию в специальных контейнерах (+37°С) в течение 2-4 часов.
Материал засеяли на 2 чашки: пластинку 20% сывороточного агара и 20% сывороточного агара с линкомицином (для подавления роста Грам+ кокков - нормальных обитателей ВДП). Пpи посеве материал втирали тампоном на поверхности 1х2 см, а затем этим же тампоном делали посев штрихами.
Чашку поместили в термостат при +37°С, повышенной влажности и 5-10% С02 на сутки.
2 этап
Учет роста. На 20% сывороточном агаре и 20% сывороточном агаре с линкомицином обнаружили рост характерных для менингококков колоний: бесцветных, нежных, полупрозрачных, средних размеров (2-3 мм) с ровными краями и гладкой поверхностью, вязкой консистенции.
Из колоний приготовили мазки и окрасили по Граму в модификации Калины. В мазках - Грам -, ярко розовые диплококки бобовидной формы.
Для накопления выделенной чистой культуры колонии отсеяли на скошенный сывороточный агар.
Посевы термостатировали сутки при +37°С и повышенной влажности.
3 этап
Учет роста. На скошенном сывороточном агаре обнаружили рост в виде сплошного полупрозрачного налета.
Для проверки чистоты накопленной культуры сделали мазки по Граму в модификации Калины. В мазках - Грам-, ярко розовые диплококки бобовидной формы.
Произвели идентификацию выделенной чистой культуры с использованием следующих тестов:
-оксидазный и каталазный – положительно,
-окисление сахаров путем посева на чашки с 20% сывороточным агаром, содержащие один из углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза, фруктоза) и индикатор;
-посев на бессывороточный МПА;
- посев на 20% сывороточный агар с 0,2% желчи. Посевы поместили в термостат на сутки при +37°С.
4 этап
Учет дифференциальных тестов:
-окисление сахаров: глюкоза «+», мальтоза «+», сахароза «-», лактоза «-», фруктоза «-»;
-на бессывороточном МПА - рост отсутствует;
-на 20% сывороточномагаре с 0,2% желчи – рост отсутствует. Идентифицировали вид нейссерий с помощью таблицы.
Произвели определение серогруппы, выделенной культуры Neisseria meningitidis в реакции агглютинации на стекле с помощью агглютинирующих сывороток против менингококков серогрупп А, В, С. Для этого на предметное стекло, разделенное маркером на три части, нанесли физ. раствор (по капле на каждую часть). Далее стерильной петлей с поверхности агаровой среды отобрали культуру менингококков и тщательно суспендировали в каплях физиологического раствора на стекле. После этого, если не выявлено спонтанной агглютинации с физ. раствором, в три подготовленные части добавили антисыворотки А, В и С (по капле) и перемешали.
Учет реакции произвели через 1 - 2 мин. Наблюдали образование крупных хлопьев на фоне полного просветления агглютинационного поля в капле с антисывороткой А и гомогенное помутнение в каплях с антисыворотками В и С.
Заключение
На основании изученных морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных свойств считаем, что из носоглотки больного с подозрением на назофарингит менингококковой этиологии выделена культура Neisseria meningitidis серогруппы А.
Протокол № 17 Бактериологическое исследование ликвора больного
сподозрением на гнойный менингит (менингококковой этиологии)
1этап исследования
1.Ликвор взяли при пункции в объеме 2,0-5,0 мл. Первую порцию направили в клинико-диагностическую лабораторию для проведения ликворологического и цитологического исследований (1,0 мл) и постановки ПЦР (0,2 мл). Вторую порцию засеяли в чашку с «шоколадным агаром» и пробирку с 20% сывороточным полужидким агаром путем накапывания непосредственно из пункционной иглы (по 0,5 мл). Еще 1 мл отобрали в пробирку для бактериоскопии и серологических исследований. Материал доставили в бактериологическую лабораторию в течение 1-2 ч. в сумках-термостатах.
2.В лаборатории посевы поместили в термостат при 370С, повышенной влажности и 5-10% СО2.
3.Приготовили 2 мазка: один окрасили метиленовым синим без фиксации; второй – по Граму. В мазке увидели соответственно диплококки бобовидной формы, часть которых располагалась внутри нейтрофилов и Гр- диплококки аналогичной формы.
4.Для экспресс-индикации ликвор исследовали в реакции латексагглютинации с соответствующим диагностикумом: наблюдали «+» результат в виде хлопьевидного осадка.
2этап
Учет роста. На «шоколадном агаре» обнаружили рост характерных для менингококков колоний: бесцветных, нежных, полупрозрачных, средних размеров (2-3 мм) с ровными краями и гладкой поверхностью, вязкой консистенции.
Из колоний приготовили мазки и окрасили по Граму в модификации Калины. В мазках - Грам -, ярко розовые диплококки бобовидной формы.
Для накопления выделенной чистой культуры колонии отсеяли на скошенный сывороточный агар.
Посевы термостатировали сутки при +37°С и повышенной влажности.
3 этап
Учет роста. На скошенном сывороточном агаре обнаружили рост в виде сплошного полупрозрачного налета.
Для проверки чистоты накопленной культуры сделали мазки по Граму в модификации Калины. В мазках - Грам-, ярко розовые диплококки бобовидной формы.