Протокол № 13 Иммунодиагностика вирусного гепатита В (ВГВ)
В качестве исследуемого материала использовали образцы сыворотки пятиобследованных с подозрением на ВГВ. В сыворотке крови определяли маркеры ВГВ: НВs- и НВе-антигены, антитела к антигенам вируса гепатита В
(анти-HBs-антитела, анти-HBc-IgM, анти-HBc-IgG, анти-HBe-IgG), ДНК вируса гепатита В.
Определение маркеров ВГВ проводили путем постановки «сэндвич»- и непрямого методов ИФА (схема 1 и схема 2), а также ПЦР.
Схема 1. Схема постановки ИФА («сэндвич») для определения антигенов ВГВ
|
1 |
|
2 |
|
3 |
4 |
5 |
6 |
|
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
A |
К+ |
|
№1 |
|
№5 |
|
К+ |
№1 |
|
№5 |
|
|
|
|
|
B |
К+ |
|
№1 |
|
№5 |
|
К+ |
№1 |
|
№5 |
|
|
|
|
|
C |
К- |
|
№2 |
|
|
|
К- |
№2 |
|
|
|
|
|
|
|
D |
К- |
|
№2 |
|
|
|
К- |
№2 |
|
|
|
|
|
|
|
E |
КК |
|
№3 |
|
|
|
КК |
№3 |
|
|
|
|
|
|
|
F |
КК |
|
№3 |
|
|
|
КК |
№3 |
|
|
|
|
|
|
|
G |
|
|
№4 |
|
|
|
|
№4 |
|
|
|
|
|
|
|
H |
|
|
№4 |
|
|
|
|
№4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
HBs-Аг |
|
|
|
HBе-Аг |
|
|
|
|
|
|
|||
Схема 2.
Схема постановки ИФА (непрямого) для определения антител к ВГВ
|
1 |
2 |
3 |
|
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
A |
К+ |
№1 |
№5 |
|
К+ |
№1 |
№5 |
К+ |
№1 |
№5 |
К+ |
№1 |
№5 |
B |
К+ |
№1 |
№5 |
|
К+ |
№1 |
№5 |
К+ |
№1 |
№5 |
К+ |
№1 |
№5 |
C |
К- |
№2 |
|
|
К- |
№2 |
|
К- |
№2 |
|
К- |
№2 |
|
D |
К- |
№2 |
|
|
К- |
№2 |
|
К- |
№2 |
|
К- |
№2 |
|
E |
КК |
№3 |
|
|
КК |
№3 |
|
КК |
№3 |
|
КК |
№3 |
|
F |
КК |
№3 |
|
|
КК |
№3 |
|
КК |
№3 |
|
КК |
№3 |
|
G |
|
№4 |
|
|
|
№4 |
|
|
№4 |
|
|
№4 |
|
H |
|
№4 |
|
|
|
№4 |
|
|
№4 |
|
|
№4 |
|
|
АнтиHBs |
|
АнтиHBс IgM |
|
АнтиHBс IgG |
|
АнтиHBеIgG |
||||||
Условные обозначения:
К+ - положительная контрольная сыворотка К- - отрицательная контрольная сыворотка КК – контроль конъюгата №1 – сыворотка №1 №2 - сыворотка №2 №3 - сыворотка №3 №4 - сыворотка №4 №5 - сыворотка №5
Учет ИФА производили с помощью мультискана (схема 3,4).
Схема 3.
Учет ИФА для определения антигенов ВГВ
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
A |
0,205 |
0,300 |
0,101 |
|
0,297 |
0,301 |
|
0,104 |
|
|
|
|
|
B |
0,295 |
0,295 |
0,103 |
|
0,280 |
0,290 |
|
0,105 |
|
|
|
|
|
C |
0,150 |
0,295 |
|
|
0,121 |
0,100 |
|
|
|
|
|
|
|
D |
0,137 |
0,286 |
|
|
0,135 |
0,102 |
|
|
|
|
|
|
|
E |
0,101 |
0,214 |
|
|
0,102 |
0,298 |
|
|
|
|
|
|
|
F |
0,105 |
0,210 |
|
|
0,100 |
0,291 |
|
|
|
|
|
|
|
G |
|
0,100 |
|
|
|
0,102 |
|
|
|
|
|
|
|
H |
|
0,105 |
|
|
|
0,100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
HBs-Аг |
|
|
|
HBе-Аг |
|
|
|
|
|
|
|
Схема 4.
Учет ИФА для определения антител к ВГВ
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
|
12 |
A |
0,205 |
0,101 |
0,401 |
0,297 |
0,296 |
0,100 |
0,291 |
0,340 |
0,305 |
0,300 |
0,100 |
|
0,299 |
B |
0,295 |
0,104 |
0,399 |
0,280 |
0,280 |
0,103 |
0,280 |
0,326 |
0,315 |
0,286 |
0,102 |
|
0,302 |
C |
0,150 |
0,099 |
|
0,121 |
0,089 |
|
0,120 |
0,390 |
|
0,127 |
0,401 |
|
|
D |
0,137 |
0,101 |
|
0,135 |
0,098 |
|
0,134 |
0,398 |
|
0,132 |
0,388 |
|
|
E |
0,101 |
0,105 |
|
0,102 |
0,299 |
|
0,100 |
0,358 |
|
0,104 |
0,098 |
|
|
F |
0,105 |
0,101 |
|
0,100 |
0,300 |
|
0,105 |
0,360 |
|
0,101 |
0,103 |
|
|
G |
|
0,391 |
|
|
0,106 |
|
|
0,100 |
|
|
0,089 |
|
|
H |
|
0,387 |
|
|
0,109 |
|
|
0,103 |
|
|
0,097 |
|
|
|
Анти- HBs-антитела |
АнтиHBс –IgM |
Анти- HBс-IgG |
Анти- HBе-IgG |
|
||||||||
Определение ДНК вируса гепатита В проводили методом ПЦР с набором специфических праймеров в режиме реального времени.
Результаты определения маркеров ВГВ
Серологический |
HBs- |
Анти- |
HBс |
HBс |
HBе- |
Анти- |
ДНК |
диагноз |
Аг |
HBs |
IgM |
IgG |
Аг |
HBе |
ВГВ |
|
|
|
|
|
|
IgG |
копий/мл |
Обследованный №1 |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
(острый ВГВ) |
|
|
|
|
|
|
|
Обследованный №2 |
+ |
- |
- |
+ |
- |
+ |
<105 |
(хронический |
|
|
|
|
|
|
|
интегративный |
|
|
|
|
|
|
|
ВГВ - носительство HBs- |
|
|
|
|
|
|
|
антигена) |
|
|
|
|
|
|
|
Обследованный №3 |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
>105 |
(хронический |
|
|
|
|
|
|
|
репликативный ВГВ) |
|
|
|
|
|
|
|
Обследованный №4 |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
(иммунитет после |
|
|
|
|
|
|
|
вакцинации) |
|
|
|
|
|
|
|
Обследованный №5 |
- |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
- |
(иммунитет после |
|
|
|
|
|
|
|
перенесенного ВГВ) |
|
|
|
|
|
|
|
Заключение
На основании результатов определения маркеров ВГВ (ИФА и ПЦР) считаем, что у обследованного №1 подтвержден диагноз «острая форма гепатита В», у обследованного №2 - «хронический интегративный ВГВ (носитель вируса ВГВ)», у обследованного №3 - «хронический репликативный ВГВ», у обследованного №4 - иммунитет после вакцинации, у обследованного №5 - иммунитет после перенесенного ВГВ.
Протокол № 14 Бактериологическое исследование отделяемого носа обследованного на
стафилококковое бактерионосительство
1 этап исследования
У обследованного на стафилококковое бактерионосительство отобрали слизь из передних отделов носа одним стерильным зондом-тампоном, вмонтированным в стерильную пробирку или одноразовую пробирку (тубсер). Для этого тампон извлекли из пробирки, ввели сначала в одну ноздрю и вращательным движением собрали материал с крыльев носа и верхнего угла носового отверстия, затем повторили манипуляцию для другой ноздри. Тампон поместили в пробирку и доставили в лабораторию.
Посев материала произвели не позднее, чем через 2 часа после его забора на желточно-солевой агар (ЖСА) непосредственно тампоном, которым забирали материал (многократно поворачивая его, чтобы перенести на среду максимальное количество взятого материала).
Чашки поместили в термостат на 24 часа при +370С, затем оставили еще на одни сутки при комнатной температуре на свету для создания оптимальных условий для пигментообразования.
2 этап исследования
Учет роста. На ЖСА обнаружены круглые, блестящие, выпуклые, непрозрачные колонии среднего размера, с золотистым пигментом, окруженные зонами опалесценции, свидетельствующими о наличии фермента патогенности лецитиназы.
Подсчитали количество таких колоний – 110 шт.
Для накопления чистой культуры не менее двух колоний, подозрительных на золотистый стафилококк, отсеяли на скошенный МПА.
Посевы термостатировали сутки при +370С.
3 этап исследования
На скошенном МПА - рост в виде гомогенного непрозрачного золотистого налета.
Для изучения морфологических и тинкториальных свойств накопленной культуры сделали мазок и окрасили по Граму. В мазках - Грам+ кокки, расположенные в виде гроздьев винограда.
Для определения фермента патогенности плазмокоагулазы (основной дифференциальный тест) в стерильную пробирку с 0,5 мл цитратной кроличьей плазмы (ЦКП) внесли одну петлю культуры стафилококка и выдержали при +370С.
Через 2 часа плазма свернулась (образовался желеобразный сгусток). Произвели пересчет количества выделенных бактерий S.aureus на 1 мл
исследованного материала с помощью соответствующей таблицы и установили, что обсемененность (110 колоний) выше 103 КОЕ/мл.
Заключение:
На основании определения мофологических, тинкториальных, культуральных, биохимических свойств считаем, что из носа обследованного выделена культура S.aureus в количестве выше 103 КОЕ/мл.