Материал: protokoly_2020

Протокол № 11 Вирусологическая диагностика гриппа

1этап

Убольного с подозрением на грипп в первый день заболевания с помощью стерильного ватного тампона отобрали отделяемое из глубоких отделов носовой полости, предварительно очистив ее от слизи. Тампоны погрузили в пробирку с 2 мл транспортной среды и 20 мг гентамицина (для подавления бактериальной флоры). Пробирки с материалом от больного доставили в холодовом режиме (+40 С) в лабораторию, где тампоны после интенсивного встряхивания отжали, полученную жидкость отцентрифугировали и использовали для заражения 9-11-дневных куриных эмбрионов.

Для этого с помощью овоскопа определили расположение и границы воздушной камеры. Скорлупу над воздушной камерой обработали 70% этиловым спиртом, затем 2% спиртовым раствором йода, и вторично спиртом. Стерильным скарификатором сделали отверстие выше границы воздушной камеры, после чего ввели, предположительно, вируссодержащую жидкость, в объеме 0,1-0,2 мл на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры в аллантоисную полость. Отверстие в скорлупе залили расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы инкубировали в термостате 48 часов при t +36-37°C (для вирусов гриппа А) и 72 часа при t +33-34°C (для вирусов гриппа В). После инкубации эмбрионы поместили на ночь в холодильник при +40 С.

2этап

Для вскрытия зараженных куриных эмбрионов поверхность скорлупы над воздушной камерой обработали спиртом и йодом. Затем скорлупу рассекли ножницами выше очерченной карандашом границы воздушной камеры. Отбросив скорлупу, отметили зоны поражения эмбриона – геморрагии, белесоватые очаги. Пастеровской пипеткой проколи хорионаллантоисную оболочку и отобрали аллантоисную жидкость.

Для индикации (обнаружения) вируса произвели постановку реакции гемагглютинации (РГА) в полистироловом планшете с аллантоисной жидкостью и 0,5% нативными куриными эритроцитами (Схема 1).

дез.р-р

Условные обозначения:

«++++» - склеивание эритроцитов в виде «зонтика» «-» - выпадение эритроцитов в осадок в виде «пуговки»

Титр вируса в РГА составил 1:160, что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (ГАЕ) вируса. Положительная РГА указывает на присутствие вируса гриппа в исследуемом материале.

Для идентификации выделенного вируса постановили реакцию торможения гемагглютинации (РТГА). Для этого использовали вируссодержащую жидкость в разведении 1/20, соответствующем 8 ГАЕ, и типоспецифические противогриппозные сыворотки типов А(H1N1), А(H2N2), А(H3N2) и типа В (Схема 2).

Заключение:

На основании полученных результатов установлено, что из отделяемого носовой полости больного с подозрением на грипп, выделен вирус гриппа типа A(H3N2).

Протокол № 12 Вирусологическое исследование фекалий больного с подозрением на

полиомиелит

1этап

Убольного с подозрением на полиомиелит в качестве исследуемого материала взяли две пробы фекалий в объеме 8-10г. Первая проба отобрана на 7 день заболевания, вторая - через 24-48 ч. Пробы обработали хлороформом для удаления бактериальной и грибковой микрофлоры, а также разъединения вирусных агрегатов. Затем приготовили их них 20% фекальную суспензию с использованием фосфатно-буферного солевого раствора с антибиотиками (смесь пенициллина и стрептомицина).

Произвели заражение 20% фекальной суспензией двух перевиваемых линий культур клеток (рабдомиосаркомы человека (RD) и мышиных клеток (L20B)) для повышения чувствительности и специфичности выявления полиовируса. В качестве отрицательного контроля использовали интактные (не зараженные) культуры клеток RDиL20В.

Перед заражением культуры клеток просматривали при малом увеличении в затемненном поле зрения для проверки качества монослоя клеток. Наблюдали неизмененные клетки полигональной формы, плотно прилегающие друг к другу, равномерно устилающие поверхность.

В пробирки с клетками обеих линий внесли одновременно по 0,2 мл 20% фекальной суспензии и инкубировали при +360С в течение 7 дней, ежедневно, микроскопируя для обнаружения цитопатического действия

(ЦПД).

2этап

На 5 день культивирования обнаружили ЦПД, проявившееся нарушением монослоя клеток, изменением их формы, отслаиванием от поверхности. Для выделения вируса произвели замораживание и оттаивание культур клеток с последующим отбором вируссодержащей жидкости.

Идентификацию выделенных штаммов полиовирусов проводили в реакции нейтрализации на культуре клеток микрометодом. Для этого вирусную суспензию и диагностические сыворотки против полиовирусов I, II и III типов смешивали в лунках планшета в объеме 0,05 мл. Планшеты инкубировали 1ч при +360С. Затем в каждую лунку добавили по 0,05 мл суспензии клеток RD и L20B. В качестве контроля использовали интактную культуру клеток. Планшеты поместили в термостат на 5 суток, ежедневно микроскопируя для обнаружения ЦПД.

3 этап

Учет реакции нейтрализации:

- вирус+сыворотка против вируса полиомиелита типа I- ЦПД,

-вирус+сыворотка против вируса полиомиелита тип IIмонослой клеток,

-вирус +сыворотка против вируса полиомиелита тип IIIЦПД,

-интактная культура клеток – монослой клеток.

Для внутритиповой дифференциации выделенного штамма полиовируса (дикий или вакцинный) поставили ИФА с использованием и ПЦР в течение 14 дней от момента выделения и идентификации штамма. Результаты ИФА и ПЦР показали, что выделенный штамм полиовируса является диким.

Заключение

На основании полученных результатов установлено, что из фекалий больного с подозрением на полиомиелит выделен вирус полиомиелита типа II (дикий).