Исследование мокроты. Выявление МБТ в мокроте имеет важное эпидемиологическое и клиническое значение.
Мокроту лучше собирать утром. Предварительно больной должен прополоскать рот, чтобы в мокроте было меньше слюны. При малом количестве мокроты ее собирают в течение суток.
При отсутствии мокроты следует вызвать ее появление раздражающими ингаляциями аэрозоля гипертонического раствора поваренной соли с содой.
Исследуют также промывные воды бронхов, получаемые после введения через трахею 10—12 мл теплого изотонического раствора хлорида натрия.
Исследование мокроты начинают с ее осмотра. У больных туберкулезом легких в мокроте могут быть прожилки или сгустки крови, кусочки обызвествленных камней бронхов — бронхолитов.
При микроскопическом исследовании окрашенных мазков мокроты у больных с деструкцией легочной ткани выявляются эластические волокна. Иногда встречаются так называемые коралловые волокна, которые образуются в результате отложения на эластических волокнах жирных кислот, а также покрытые известью эластические волокна и аморфные известковые частицы.
Для выявления в мокроте МБТ ее исследуют неоднократно, направляя в лабораторию утреннюю порцию не менее 3 дней подряд. В ряде случаев МБТ могут быть обнаружены в мокроте и при отсутствии рентгенологических изменений в легких (в этом случае нельзя исключить и язвенный туберкулез бронха). Проводить исследование мокроты необходимо до начала противотуберкулезной химиотерапии.
Выявление МБТ в патологическом материале осуществляется бактериоскопическим, бактериологическим (культуральным) и биологическим методами.
Кроме мокроты, объектами исследования для обнаружения МБТ могут быть также моча, кал, спинномозговая жидкость, экссудат из полостей, биоптаты различных тканей.
Основным методом выявления МБТ является бактериоскопический. Во многих развивающихся странах он широко применяется не только для диагностики, но и для выявления больных туберкулезом при массовых обследованиях населения.
При прямой бактериоскопии препарат окрашивают по методу Циля — Нильсена: вначале карболовым раствором фуксина, а затем после обесцвечивания 5 % раствором серной кислоты или 3 % раствором солянокислого спирта, докрашивают 0,25 % раствором метиленового синего. Окрашенные препараты микроскопируют в иммерсионной системе. МБТ окрашиваются в красный, а окружающий фон и некислотоустойчивые микроорганизмы — в синий цвет.
Информативность бактериоскопического метода выявления МБТ увеличивается на 14—30 % при применении люминесцентной микроскопии. Для окраски препарата используют флюорохромы — органические красители, флюоресцирующие при освещении ультрафиолетовыми, фиолетовыми или синими лучами. Такими красителями являются аурамин, родамин С. Препарат исследуют с помощью люминесцентного микроскопа. МБТ светятся золотисто-желтым цветом на темном фоне.
Для обнаружения бактериоскопическим методом МБТ в препарате необходимо, чтобы в 1 мл мокроты содержалось не менее 100 000 микробных тел. При меньшем числе микобактерий исследование может дать ложноотрицательный результат.
Для увеличения количества МБТ в единице исследуемого объема мокроты используют методы флотации и седиментации, особенно при отрицательных результатах прямой бактериоскопии.
Наибольшее распространение получил метод флотации, основанный на том, что после встряхивания водной суспензии с углеводородом МБТ всплывают вместе с образующейся пеной на поверхность. В качестве углеводорода используют бензин, бензол, ксилол. Образующееся на поверхности сливкообразное (флотационное) кольцо из частиц углеводорода с микобактериями служит материалом для приготовления препаратов. При использовании метода флотации число положительных результатов бактериоскопии увеличивается на 10 %.
———————————————————————————————————————————
ОАК. У больных туберкулёзом изменения в общем анализе крови не патогномоничны. При ограниченных и малоактивных формах туберкулёза характерна гипохромия эритроцитов при нормальном их количестве. Количество ретикулоцитов при компенсированной стадии туберкулёза колеблется от 0.1 до 0.6%, при субкомпенсированной — от 0,6 до 1,0%, а для декомпенсированной характерен 1% ретикулоцитов. При туберкулёзе в части случаев может отмечаться умеренный лейкоцитоз (до 15 тыс. лейкоцитов), реже лейкопения, Наиболее часто сдвиги возникают в лейкоцитарной формуле. Увеличение СОЭ указывает на наличие патологического процесса (инфекционно-воспалительного, гнойного, септического, гемобластоза, лимфогранулематоза и др.) и служит показателем его тяжести
ОАМ. При туберкулёзе мочевой системы исследование мочи является основным лабо раторным методом диагностики. Можно наблюдать лейкоцитурию, эритроцитурию, протеинурию, гипоизостенурию, туберкулёзную микобактериурию, неспецифичес кую бактериурию.
БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРОВИ
У больных с неактивным туберкулёзом лёгких и других органов общий белок и белковые фракции сыворотки крови не изменены и определяют их нормальное содержание.
При острых формах заболевания, а также при обострении и прогрессировании хронических форм туберкулёза уменьшается альбумин-глобулиновый коэффициент.
У больных туберкулёзом лёгких с преобладанием экссудативного компонента воспаления наблюдают снижение антикоагулянтной активности крови. У больных с малой распространённостью специфического поражения в лёгких с преобладанием продуктивного компонента воспаления внутрисосудистая гемокоагуляция выражена незначительно.
ИССЛЕДОВАНИЕ СВЁРТЫВАЮЩЕЙ СИСТЕМЫ КРОВИ
Для контроля за состоянием свёртывающей системы крови у больных туберкулё зом лёгких необходимо проводить определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), фибриногена, тромбинового времени, протромбинового индекса, а также времени кровотечения и времени свёртывания крови.
ГОРМОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Установлено, что субклинический гипотиреоз выявляют у 38-45% больных туберкулёзом лёгких, и наиболее часто его диагностируют при диссеминированной и фиброзно-кавернозной формах процесса. При этих же формах наиболее резко снижены уровни как Т3 ,так и Т4 , и наступает дисбаланс этих гормонов в виде повышения соотношения Т4 /Тз .
Функцию коры надпочечников оценивают по уровню кортизола в сыворотке крови, а инкреторную функцию поджелудочной железы — по концентрации иммунореактивного инсулина. В острую фазу инфекционного заболевания возрастает потребность в эндогенном кортизоле и инсулине. Гиперинсулинемия свидетельствует также об инсулинрезистентности тканей организма, что характерно для любого активного воспалительного процесса, в частности специфического.
В целом снижение уровней тиреоидных гормонов, их дисбаланс, гиперкортизолемия и гиперинсулинизм наибольшей степени достигают у больных с тяжёлым течением туберкулёзного процесса, с обширными поражениями лёгких и выраженными симптомами туберкулёзной интоксикации.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.
Традиционные микробиологические методы диагностики туберкулёза — бактериоскопическое и культуральное исследования. Современными методами считают куль тивирование микобактерий туберкулёза в автоматизированных системах, постановку ПЦР. Однако все эти методы обязательно сочетают с классическими бактериологи ческими методами.
Питательные среды.
В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулёза и определения его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендует среду Левенштейна-Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой рост микобактерий получают на 20—25-й день после посева бактериоскопически положительного матери ала. Посевы бактериоскопически отрицательного материала требуют более длительного периода инкубации (до 10-12 нед). В нашей стране широкое распространение получила предложенная Э.Р. Финном яичная среда Финн-II. Она отличается тем, что вместо L-аспарагина в ней используют глутамат натрия, запускающий иные пути синтеза аминокислот микобактерий. Рост появляется на этой среде несколько раньше, а частота выделения микобактерий на 6-8% выше, чем на среде Левенштейна-Йенсена. Для повышения эффективности бактериологической диагностики внелёгочного туберкулёза целесообразно включать в комплекс питательных сред модифициро ванные среды Финн-II. Для ускорения роста в питательную среду Финн-II дополнительно вводят натрий тиогликолат 0,05%, снижающий концентрацию кислорода. Для защиты ферментных систем микобактерий от токсичных продуктов перекисного окисления липидов в питательную среду Финн-II вводят антиоксидант α-токоферола ацетат в концентрации 0,001 мкг/мл. Посев диагностического материала производят по стандартной методике. В противотуберкулёзных лабораториях России используют и другие модифика ции плотных питательных сред; предложенную Г.Г. Мордовским питательную среду «Новая», разработанные В.А. Аникиным питательные среды А-6 и А-9 и др.
———————————————————————————————————————————
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из наиболее быстрых и информативных методов выявления МБТ
Принцип метода состоит в увеличении в 106—108 раз числа копий специфического участка ДНК МБТ, катализируемого in vitroRH К-полимеразой в автоматическом режиме
В искусственных условиях воспроизведение процесса репликации специфического или определенного вида или рода возбудителей участка генома возможно при условии знания его нуклеотидной последовательности
Применение методов детекции продуктов репликации таких участков (ампликоны) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе
Метод обладает высокой чувствительностью – он позволяет обнаруживать возбудитель при содержании всего нескольких сотен микроорганизмов в 1 мл исследуемого материала (мокроты, крови, плеврального выпота и т.д.)
Результат исследования можно получить в течение 5–6 ч.
Этот высокочувствительный метод в ряде случаев может давать ложноположительные результаты, что ограничивает достоверность исследования
Достоинства метода ПЦР
⎯ Прямое определение наличия возбудителей
⎯ Быстрота проведения анализа ПЦР можно проводить с любым диагностическим материалом
⎯ Высокая специфичность
⎯ Высокая чувствительность
⎯ Внедрение ПЦР позволило: значительно сократить сроки подтверждения диагноза туберкулеза контролировать эффективность химиотерапии у больных туберкулезом
DNA-STRIP технология
Принцип метода
На ДНК-стрипы нанесены специфические пробы, которые комплементарны амплифицируемым нуклеиновым кислотам (ампликонам). После денатурации одноцепочечные ампликоны специфически связываются с пробами на стрипах (гибридизация) и затем визуализируются в последовательной энзиматической реакции (со стрептавидином и щелочной фосфатазой).
———————————————————————————————————————————
1. Метод абсолютных концентраций;
2. Метод соотношения резистентности;
3. Метод пропорций.
Метод абсолютных (предельных) концентраций заключается в следующем. Микобактерий выращивают на питательных средах, содержащих противотуберкулезные препараты (ПТП) в различных концентрациях. Определение лекарственной чувствительности МБТ может быть
• прямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами патологического материала) Позволяет значительно ускорить процесс получения результата, но им можно пользоваться только тогда, когда микобактерий обнаруживаются в исследуемом материале бактериоскопически и содержатся в нем в значительном количестве.
• непрямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами выделенных культур микобактерий).
Лекарственную чувствительность можно определять на плотных и жидких питательных средах. В современной лабораторной практике ее обычно определяют на среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмала. При определении лекарственной чувствительности на плотных питательных средах результат учитывают через 3 недели после посева по макроросту МБТ на поверхности среды, на жидких питательных средах — через 10-12 дней по наличию микроколоний в виде переплетающихся жгутов и кос в мазках из осадка.
Плюсы: На плотных средах можно получить более четко сравнимые результаты. Определение лекарственной чувствительности на жидких средах более трудоемко, требует микроскопии препаратов, но результат может быть получен в более короткие сроки. Недостатком этого способа является то, что больные, леченные антибактериальными препаратами, могут выделять микобактерий, лишенные корд-фактора, не дающие при размножении жгутов или паукообразных микроколоний, наличие которых служит критерием устойчивости к препарату.
Метод соотношения резистентности заключается в определении соотношения минимальных ингибирующих концентраций противотуберкулезных препаратов для тестируемого штамма и референс-штаммаH37R.V, чувствительного ко всем препаратам. Величина соотношения 2 и менее характеризует штамм как чувствительный, 8 и более — как устойчивый.
Вариантом метода минимальных ингибирующих концентраций является E-test. Лекарственная устойчивость микобактерий с использованием этого метода определяется на чашках с агаровой средой, на которые помещают полоски, содержащие градиент концентраций противотуберкулезных препаратов. Чувствительность микобактерий к препаратам оценивается по наличию зоны ингибирования роста микобактерий вокруг полоски. ИспользованиеE-test позволяет определять лекарственную чувствительность МБТ в течение 5-10 дней.
Метод пропорций заключается в определении соотношения числа колоний, выросших на среде, содержащей противотуберкулезный препарат, и числа колоний в контрольной пробирке, не содержащей препарата. Это соотношение является отражением пропорции резистентных бактерий в популяции. Метод позволяет количественно оценить степень резистентности штамма МБТ, однако широкое применение его в классическом варианте затруднено вследствие большой трудоемкости. Определение лекарственной чувствительности микобактерий методом пропорций может проводиться с использованием автоматических системВАСТЕС, MGIT, Esp Culture Systemи др.
В качестве критериев для отнесения штаммов МБТ к категории чувствительных или устойчивых используют пороговые значения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) ПТП, избранные на основе комплекса микробиологических, фармакокинетических и клинических показателей.
Данные о величине МИК ПТП в отношении штаммов МБТ, выделенных от больных, служат микробиологическим критерием для определения величины пороговых концентраций.
Кроме того, при определении пороговых МИК учитывают данные по фармакокинетикс ПТП.
Основным показателем при этом является максимальная концентрация ПТП, которая создается в сыворотке крови после приема ПТП в среднетерапевтической дозе.
Четкая зависимость между этим показателем и величинами пороговых МИК отсутствует.
В самом общем виде можно лишь сказать, что пороговые МИК не могут быть выше максимально достижимых в сыворотке крови.
И, наконец, третьим критерием для определения пороговых значений МИК служат данные о клинической эффективности ПТП при заболевании, вызываемом микроорганизмами с различными МИК. Таким образом, предложенные в разных странах пороговые значения МИК ПТП являются плодом консенсуса между ведущими экспертами, а не результатом точных расчетов. По мере накопления опыта их периодически пересматривают. Несмотря на определенную условность рекомендованных пороговых значений МИК ПТП, они являются единственной основой для первого этапа интерпретации результатов оценки чувствительности МБТ к ПТП.
———————————————————————————————————————————