Материал: 2_MIKROBIOLOGIYa_temy_5-9_FIZIOLOGIYa_I_IZMENChIVOST_MIKROORGANIZMOV
Рис. 8. Способы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
1. Принцип диффузионных методов основан на диффузии в агар антибиотиков, нанесенных на бумажные диски или полоски, при наложении их на засеянную культуру микроорганизмов. Диффузия антибиотика приводит к образованию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков или полосок после инкубации чашек в термостате при температуре 35о-37оС в течение суток, если исследуемый штамм проявляет чувствительность к препаратам.
При использовании диско-диффузионного метода результат учитывают путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах, сравнивая с данными таблиц из методических указаний (МУК «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»). На основании размеров зон культуры относят к одной из трех групп: чувствительные, промежуточные и резистентные.
Диско-диффузионный метод относится к полуколичественным. Он прост в исполнении, экономичен, не требует специального оборудования, доступен для любой бактериологической лаборатории, поэтому именно он является основным способом тестирования чувствительности микроорганизмов и используется в рутинной практике.
При исполнении метода Е-тестов используют не диски, а полоски, на определенные участки которых антибиотик нанесен в различных концентрациях - по градиенту концентраций от максимальной к минимальной. В результате формирующиеся зоны задержки роста культуры приобретают эллипсовидную форму. В месте пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е-теста находится минимальная подавляющая концентрация (МПК) антибиотика.
Е-тест сочетает простоту постановки метода бумажных дисков и точность метода серийных разведений, является количественым, однако ввиду высокой стоимости тестполосок не нашел широкого применения в практике.
2. Методы серийных разведений основаны на приготовлении последовательных двукратных разведений антибиотика (АБ) от максимальной рабочей концентрации к минимальной. Разведения можно выполнять в жидкой среде (в пробирках или лунках полистироловых планшет) или агаре. В результате в каждой последующей пробирке (или лунке) ряда концентрация АБ уменьшается в 2 раза по сравнению с предыдущей. Далее взвесь, приготовленную из чистой культуры исследуемых микроорганизмов, вносят во все разведения АБ в бульоне или на поверхность агара в чашках. Результаты учитывают после термостатирования в течение суток при 35о-37оС по наличию/отсутствию роста микроорганизмов в средах. Находят последнюю пробирку ряда (лунку, чашку) среди тех, где еще отсутствуют признаки роста микроорганизмов - она соответствует наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей видимый рост штамма. Такая концентрация называется минимальной подавляющей концентрацией (МПК), или минимальной ингибирующей концентрацией (МИК); измеряется в мг/л.
Данные методы являются точными, количественными, однако они очень трудоемки. Это не позволяет их использовать в повседневной практике.
3. Атоматизированные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБ предусматривают учет результатов с помощью приборов типа бактериологических анализаторов. Для тестирования используют методы серийных разведений или пограничных концентраций, проводимые в коммерческих полистироловых 96-луночных планшетах. В лунках планшет находятся лиофильно высушены убывающие концентрации антибиотиков в бульоне или только в две концентрации - высокая и низкая (высокая соответствует границе между устойчивыми и умеренно устойчивыми штаммами, а низкая концентрация — границе между умеренно устойчивыми и чувствительными штаммами). Далее в лунки вносят суспензии исследуемых штаммов в одинаковой дозе с соблюдением
правил асептики и инкубируют при 37оС от 4-6 часов (в экспресс-режиме) до 24ч. Результаты регистрируют спектрофотометрически или кондуктометрически сразу после появлении признаков размножения нечувствительных к данному антибиотику штаммов. Процессы инкубирования, встряхивания, определения оптической плотности взвеси в каждой лунке, графическое отображение результатов, определение степени чувствительности и печать протокола исследования выполняются с помощью приборов. Одновременно возможно тестирование культуры к 20 и более антибиотикам.
Данный метод является наиболее точным, стандартным и нетрудоемким, однако имеет высокую стоимость и потому доступен только крупным диагностическим центрам.
4. Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБ позволяют сократить время исследования до нескольких часов, однако являются ориентировочными и требуют подтверждения в стандартных тестах. К этой группе можно отнести:
методы регистрации ферментативной активности микроорганизмов при росте нечувствительных штаммов на дифференциальных средах в присутствии антибиотиков;
методы, основанные на изменении цвета редокс-индикаторов при изменении окислительно-восстановительного потенциала среды в процессе роста микробов в присутствии антибиотиков.
Методики проведения лабораторных работ
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений
Цель исследования - определение минимальной, или подавляющей, концентрации антибиотика, ингибирующей видимый рост исследуемой культуры бактерий (МИК, или МПК).
1 этап. Готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мг/л) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него делают последовательные двукратные разведения антибиотика в 7-8 пробирках в соответствии со схемой 3. Далее ко всем разведениям добавляют по 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии с концентрацией бактерий, соответствующей стандарту мутности 0,5 по MсFarland (108м.т./ мл). В предпоследнюю пробирку ряда вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры), а в последнюю - 1 мл бульона и 1 мл антибиотика (контроль АБ). Посевы инкубируют при 370С 24 часа.
Схема 3 Определение чувствительности бактериальной культуры к антибиотику методом серийных
разведений
№ пробирок
Разведение
антибиотика
Ингредиенты
МПБ (мл)
Бензиллпеницил лин (100 мг/л)
взвесь S.aureus
(мл)
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
50 |
25 |
12,5 |
6,25 |
3,12 |
1,56 |
0,78 |
0,39 |
КК |
КАБ |
0,1 |
0,1 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
0,1 |
1,0 |
1,0 |
0,1 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
0,1 |
– |
1,0 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
– |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1,0 в дез.раствор
2 этап. Учитывают результаты опыта по помутнению питательной среды. Последняя опытная пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемого штамма S.aureus под влиянием антибиотика в минимальной ингибирующей концентрации (МИК, МПК).
Пример учета:
№ пробирки |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
|
"+" (диффузно-мутящий |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
рост) |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
|
"–" (прозрачная среда - |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
отсутствие роста) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
В данном примере МИК бензилпенициллина для S.aureus – 6,25 мкг/мл. Оценку результатов проводят, используя таблицу из МУК «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» 4.2.1890-04. В таблице представлены значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов (табл.27). Делают заключение о степени чувствительности исследуемого штамма S.aureus к бензилпенициллину.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам дискодиффузионным методом
1этап. 1 мл суспензии (108м.т./ мл) исследуемой бактериальной культуры распределяют «сплошным газоном» на пластинке агара Мюллера-Хинтона. Засеянную поверхность подсушивают и на нее с помощью стерильного пинцета накладывают бумажные диски,
содержащие определенную дозу разных антибиотиков на одинаковом расстоянии друг от друга и от края чашки (2см). Посев инкубируют при 370С 24 часа.
2этап. Учет результатов производят путем измерения диаметров (в мм) зон задержки роста микробов вокруг дисков с антибиотиками. Оценку результатов проводят по таблице из МУК (табл.27), в которой представлены пограничные значения диаметров для устойчивых, промежуточных и чувствительных штаммов.
Кчувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при использовании обычных терапевтических доз антибиотика, они не имеют механизмов резистентности; для подавления роста культур с промежуточной чувствительностью требуются введение максимально разрешенных концентраций. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.
Таблица 27
Критерии интерпритации результатов определения чувствительности Staphilococcus spp.: пограничные значения диаметров зон подавления роста (мм) и МПК (мг/л) АБП
Антибактериальн |
|
Соде |
|
Диаметр зон подавления |
|
|
|
МПК |
|
|
|||||
ые |
|
ржа- |
|
|
|
роста |
|
|
|
|
(мг/л) |
|
|
||
препараты |
|
ние в |
|
|
|
(мм) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
диске |
|
Р |
|
П |
|
Ч |
Р |
|
П |
Ч |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
2 |
|
3 |
|
4 |
|
5 |
6 |
|
|
|
7 |
8 |
|
|
|
|
|
Бета-лактамы1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Бензилпеницилл |
10 |
|
≤28 |
|
- |
|
≥9 |
≥0,25 |
|
- |
≤0,12 |
|
|||
ин |
|
ЕД |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Оксациллин |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
S.aureus |
1 |
|
≤10 |
|
11-12 |
|
≥13 |
≥4 |
|
- |
≤2 |
|
|||
Коагулазонегати |
1 |
|
≤17 |
|
- |
|
≥18 |
≥0,5 |
|
- |
≤0,25 |
|
|||
вные |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
стафилококки |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Аминогликозиды |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Канамицин |
30 |
|
≤13 |
|
14-17 |
|
≥18 |
≥84 |
|
32 |
≤16 |
|
|||
Гентамицин |
10 |
|
≤12 |
|
13-14 |
|
≥15 |
≥16 |
|
8 |
≤4 |
|
|||
Тобрамицин |
10 |
|
≤12 |
|
13-14 |
|
≥15 |
≥16 |
|
8 |
≤4 |
|
|||
Нетилмицин |
30 |
|
≤12 |
|
13-14 |
|
≥15 |
≥32 |
|
16 |
≤8 |
|
|||
Амикацин |
30 |
|
≤14 |
|
15-16 |
|
≥17 |
≥64 |
|
32 |
≤16 |
|
|||
|
|
|
|
|
Хинолоны |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Норфлоксацин |
10 |
|
≤12 |
|
13-16 |
|
≥17 |
≥16 |
|
8 |
≤4 |
|
|||
Эноксацин |
10 |
|
≤14 |
|
15-17 |
|
≥18 |
≥8 |
|
4 |
≤2 |
|
|||
Пефлоксацин |
5 |
|
≤15 |
|
16-21 |
|
≥22 |
≥8 |
|
4 |
≤1 |
|
|||
Офлоксацин |
5 |
|
≤12 |
|
13-15 |
|
≥16 |
≥8 |
|
4 |
≤2 |
|
|||
Ципрофлоксацин |
5 |
|
≤15 |
|
16-20 |
|
≥21 |
≥4 |
|
2 |
≤1 |
|
|||
Ломефлоксацин |
10 |
|
≤18 |
|
19-21 |
|
≥22 |
≥8 |
|
4 |
≤2 |
|
|||
Левофлоксацин |
5 |
|
≤13 |
|
14-16 |
|
≥17 |
≥8 |
|
4 |
≤2 |
|
|||
Сапрофлоксацин |
5 |
|
≤15 |
|
16-18 |
|
≥19 |
≥2 |
|
1 |
≤0,5 |
|
|||
Гатифлоксацин |
5 |
|
≤14 |
|
15-17 |
|
≥18 |
≥8 |
|
4 |
≤2 |
|
|||
|
|
|
|
Тетрациклины |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Тетрациклин |
30 |
|
≤14 |
|
15-18 |
|
≥19 |
≥16 |
|
8 |
≤4 |
|
|||
Доксициклин |
30 |
|
≤12 |
|
13-15 |
|
≥19 |
≥16 |
|
8 |
≤4 |
|
|||
Миноциклин |
30 |
|
≤14 |
|
15-18 |
|
≥19 |
≥16 |
|
8 |
≤4 |
|
|||
|
|
|
|
Макролиды |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Эритромицин |
15 |
|
≤13 |
|
14-22 |
|
≥23 |
≥8 |
|
1-4 |
≤0,5 |
|
|||
Кларитромицин |
15 |
|
≤13 |
|
14-17 |
|
≥18 |
≥8 |
|
4 |
≤2 |
|
|||
Азитромицин |
15 |
|
≤13 |
|
14-17 |
|
≥18 |
≥8 |
|
4 |
≤2 |
|
|||
|
|
|
|
Линкозамиды |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Линкомицин |
15 |
|
<17 |
|
17-20 |
|
≥21 |
>8 |
|
|
4-8 |
≤2 |
|
||
Клиндамицин |
2 |
|
≤14 |
|
15-20 |
|
≥21 |
≥4 |
|
1-2 |
≤0,5 |
|
|||
|
|
|
|
Гликопептиды |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Ванкомицин |
30 |
|
- |
|
- |
|
≥15 |
≥32 |
|
|
8-16 |
≤4 |
|
||
|
|
|
|
Другие препараты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Хлорамфеникол |
30 |
|
≤12 |
|
13-17 |
|
≥18 |
≥32 |
|
16 |
≤8 |
|
|||
Ко-тримоксазол |
1,25/ |
|
≤10 |
|
11-15 |
|
≥16 |
≥4/76 |
|
- |
≤2/38 |
|
|||
|
23,75 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Нитрофурантоин |
300 |
|
≤14 |
|
15-16 |
|
≥17 |
≥128 |
|
64 |
≤32 |
|
|||
Рифампицин |
5 |
|
≤16 |
|
17-19 |
|
≥20 |
≥4 |
|
2 |
≤1 |
|
|||
Фузидин |
10 |
|
<15 |
|
15-21 |
|
≥22 |
≥32 |
|
4-6 |
≤2 |
|
|||
Линезолид |
30 |
|
- |
|
- |
|
≥21 |
- |
|
|
|
- |
≤4 |
|
|
Антибактериальн |
|
Соде |
|
Диаметр зон подавления |
|
МПК |
|
|||
ые |
|
ржа- |
|
|
роста |
|
|
(мг/л) |
|
|
препараты |
|
ние в |
|
|
(мм) |
|
|
|
|
|
|
|
диске |
|
Р |
П |
Ч |
Р |
|
П |
Ч |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
2 |
|
3 |
4 |
5 |
6 |
|
7 |
8 |
Штаммы, устойчивые к оксациллину, должны однозначно рассматриваться как устойчивые ко всем доступным беталактамам.
4. Механизмы формирования резистентности бактерий и методы определения маркеров резистентности.
Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и другим антибактериальным средствам - это способность микроорганизмов размножаться в присутствии различных концентраций этих препаратов.
По происхождению различают два вида устойчивости:
Первичная (видовая) – складывается в процессе эволюции видов, например, микоплазмы не чувствительны к пенициллину из-за отсутствия у них клеточной стенки;
Приобретенная - возникает в изначально чувствительной к препарату популяции в процессе ее жизнедеятельности; такая резистентность может быть результатом:
а) мутаций в хромосомных генах, контролирующих образование структурных и химических компонентов клетки, являющихся «мишенью» для препарата;
б) передачи внехромосомных факторов наследственности (R-плазмид, умеренных фагов) при рекомбинациях.
Биохимические механизмы резистентности бактерий к антибиотикам:
1) образование ферментов, разрушающих антибиотики.
Наиболее частый механизм резистентности связан с синтезом β-лактамаз. β-лактамазы — различные бактериальные ферменты, способные расщеплять или ингибировать β-лактамные антибиотики, содержащие в своей структуре циклическую амидную связь. Такие ферменты могут иметь как Грам+, так и Грамбактерий.
В практике очень важно быстро установить их наличие для определения плана лечения пациента, так как штаммы, продуцирующие β-лактамазы, будут не чувствительны к действию β-лактамных антибиотиков (всей группы или отдельных представителей);
2)утрата проницаемости клеточной стенки для определенного препарата;
3)нарушение в системе специфического транспорта данного препарата в бактериальную клетку;
4)возникновение у микроорганизмов альтернативного пути образования жизненно важного метаболита, заменяющего основной путь, блокированный препаратом.
Методы выявления маркеров резистентности бактерий к антимикробным препаратам
1)фенотипические:
определение β-лактамаз в хромогенных тестах - основаны на изменении цвета специальных субстратов и индикаторов, которые вместе с антибиотиком наносятся на диагностические диски, полоски или находятся в питательной среде; окрашивание или обесцвечивание появляется в результате гидролиза антибиотика под действием фермента β-лактамазы (например, нитроцефиновый тест);