Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

ВВЕДЕНИЕ. В 1822 г. Карл Вильгельм Шееле впер-

ПРОМЫШЛЕННОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ИЗ САХАРОВ. Для

вые выделил D-лимонную кислоту из лимонного со-

промышленного производства лимонной кислоты ис-

ка и изучил ее свойства. Значительные количества

пользуют твердофазную ферментацию сахаров под

этой кислоты содержатся во многих фруктовых со-

действием A. niger. В открытые металлические ре-

ках. Хансу Кребсу принадлежит одно из самых заме-

зервуары, устойчивые к кислой среде, помещают

чательных открытий в биохимии: в 1937 г. он пока-

раствор сахаров и споры гриба. Для дополнительной

зал, что лимонная кислота является ключевым

аэрации и отведения тепла в суспензию пропускают

соединением аэробного обмена веществ (цикл три-

воздух с интенсивностью до 10 объемов ферментера

карбоновых кислот, цикл Кребса). За сутки в орга-

в минуту. Через пять суток образуется хорошо разви-

низме взрослого человека образуется около 1,5 кг

тый мицелий, в котором активируется синтез лимон-

лимонной кислоты, которая затем подвергается

ной кислоты (продолжительность всего процесса

дальнейшим превращениям. Лимонная кислота –

8 сут.). После удаления мицелия проводят экстрак-

сильная кислота с трехступенчатой диссоциацией:

цию горячей водой и осаждение цитрата. Выход про-

рКа при 25 °С составляют 3,13, 4,78 и 6,43 соот-

дукта достигает 50 г/кг сахара. В современной

ветственно. В 1%-м растворе лимонной кислоты

промышленности цитрат получают в башенных био-

рН 2,2. Наличие трех карбоксильных и одной гидро-

реакторах или реакторах с механическим перемеши-

ксильной группы определяет способность лимонной

ванием в стерильных условиях. Объем таких реакто-

кислоты к образованию комплексов с двух- и трехва-

ров от 100 до 500 м3. рН продукта на выходе ~2,0,

лентными катионами. Промышленное получение ли-

поэтому ферментеры должны быть выполнены из ус-

монной кислоты основано на ферментативном про-

тойчивой к агрессивной среде высококачественной

цессе. Мировое производство лимонной кислоты

стали. В качестве экономически выгодного сырья ис-

составляет 1 200 000 т в год (2005), объем рын-

пользуют гидролизат крахмала или дешевые источ-

ка – около 1 200 млрд долларов США. Лимонная

ники сахарозы. Эффективность образования цитрата

кислота используется как подкислитель и консерви-

зависит от содержания ионов марганца в среде:

рующий агент в пищевой промышленности, компле-

в среде с низким содержанием марганца (менее

ксообразователь в металлургии, средство для смяг-

2 мкг/л) синтезируется большое количество продук-

чения воды при производстве стиральных порошков

та. Наращивание клеточной массы завершается че-

и для неотложной помощи при тяжелых отравлениях

рез 48 ч роста при рН 5. Последующее искусствен-

солями металлов.

ное закисление среды до рН 2,5, добавление сахаров

МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. Некоторые плес-

при непрерывной ферментации и интенсификация

невые грибы, в частности Aspergillus niger, в услови-

аэрации способствуют образованию лимонной кисло-

ях избытка глюкозы и интенсивной аэрации во время

ты. Продукт выделяется клетками во внеклеточную

экспоненциальной фазы роста и после ее окончания

среду. В расчете на потребленную глюкозу выход ли-

выделяют в среду значительное количество лимон-

монной кислоты более 80%. По завершении фер-

ной кислоты. Несмотря на то что многие промежу-

ментации мицелий отфильтровывают, в раствор цит-

точные продукты цикла Кребса оказывают регулятор-

рата добавляют Ca(OH)2, далее цитрат кальция

ное влияние на другие процессы обмена веществ,

переводят в кислоту серной кислотой. Сырой продукт

возможно создание штаммов A. niger – суперпроду-

обрабатывают активированным углем и пропускают

центов лимонной кислоты. Во-первых, запас оксало-

через ионообменную колонку. В растворе кристалли-

ацетата постоянно растет за счет активности находя-

зуется очень чистая лимонная кислота. Расход гипса

щиейся в цитоплазме пируваткарбоксилазы, которая

более 1 т/т лимонной кислоты. В настоящее время

катализирует присоединение молекулы СО2 к пиру-

большое распространение получает другой более

вату с образованием оксалоацетата (анаплеротиче-

экономичный способ очистки лимонной кислоты: по-

ская, т. е. возмещающая реакция). Во-вторых, ли-

сле реакции цитрата с трилауриламином продукт эк-

монная кислота синтезируется в митохондриях,

страгируют с помощью алканов и 1-октанола. Раство-

секретируется в цитоплазму, а затем выводится из

рители и трилауриламин можно вновь использовать

клетки. Причина существования такого направленно-

после соответствующей обработки. В последние годы

го транспорта в том, что цитоплазматическая малат-

был разработан метод получения D-лимонной кисло-

дегидрогеназа катализирует превращение оксалоаце-

ты из фракций нефти с помощью особого штамма

тата в яблочную кислоту, молекулы которой

дрожжей. Проект был доведен до этапа создания пи-

проникают в митохондрии, заменяя молекулы лимон-

лотной установки, однако в связи с резким повыше-

ной кислоты (принцип антипорта).

нием цен на нефть пока отложен.

аминокислоты

Молочная и глюконовая кислоты

ВВЕДЕНИЕ. Объем мирового производства молочной

кислоты за 2001 г. составил 860 000 т, из которых

30 000 т получены путем ферментации. Благодаря

умеренно кислому вкусу и консервирующим свойст-

и

вам молочная кислота находит широкое применение

в пищевой промышленности (до 85% всего произве-

кислоты

денного объема). Молочная кислота технической чи-

стоты используется в кожевенном и текстильном

производствах, а также служит сырьем для синтеза

Спирты,

полимеров, поддающихся биологической деградации,

WorksТМ), которое разлагается под действием микро-

например полилактидов. Ежегодно в мире произво-

дится более 100 000 т L-молочной кислоты, которая

идет на производство полиэфирного волокна (Nature

организмов. Производство D-глюконовой кислоты, ее

натриевой соли и δ-лактона – изомера D-глюконовой

кислоты составляет 60 000 т в год. δ-Лактон также

применяется в пищевой промышленности в качестве

мягкого подкислителя. При лечении болезней, свя-

занных с недостатком Ca2+ и Fe3+ в организме, в

растворы для инфузии добавляют глюконаты кальция

и железа, так как эти соли не токсичны и очень хоро-

шо растворимы в воде. Глюконовая кислота – силь-

ный комплексообразователь в щелочных условиях,

поэтому значительная часть (около 50%) глюконо-

вой кислоты в виде натриевой соли используется в

технических целях – как средство для очистки сте-

кол, удаления ржавчины и разрыхления цемента, а

также в текстильной промышленности для предот-

вращения загрязнения тканей солями металлов. рКа

D-глюконовой кислоты 3,7.

МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. Для промышлен-

ного прозводства молочной кислоты используют

штаммы Lactobacillus. Выбор того или иного штамма

зависит от наиболее доступного источника углерода.

Полное превращение субстрата происходит только в

случае гомоферментативного молочнокислого бро-

жения – из 1 моль D-глюкозы образуется 2 моль

L-молочной кислоты. Процесс неполного окисления

D-глюкозы – образование D-глюконовой кислоты –

описан для некоторых грибов (Aspergillus niger, неко-

торых представителей рода Penicillium), а также

для уксуснокислых бактерий рода Gluconobacter.

У грибов реакцию катализирует глюкозооксидаза –

флавинсодержащий фермент, локализованный в

клеточной стенке. В условиях промышленной фер-

ментации глюкозооксидаза обнаруживается и в сре-

де роста гриба. Штаммы Gluconobacter осуществля-

ют неполное окисление D-глюкозы с помощью

мембраносвязанного фермента D-глюкозодегидроге-

назы. Так же, как алкоголь- и альдегиддегидрогеназы

уксуснокислых бактерий, D-глюкозодегидрогеназа в

28

клетках Gluconobacter является ПХХ-зависимым

ферментом.