Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

ВВЕДЕНИЕ. Аспартам (метиловый эфир L-α-аспартил- L-фенилаланина) – это низкокалорийный искусственный подсластитель, который по сладости в 200 раз превосходит сахар, полученный из сахарной свеклы. Объем производства аспартама составляет 30 000 т/г (2004). Исходными веществами для синтеза аспартама являются L-аспарагиновая кислота и L-фенилала- нин. При химическом синтезе аспартама требуются дополнительные затраты на введение защитных групп в молекулы исходных веществ, поэтому в настоящее время применяют ферментативные методы получения этого продукта.

L-АСПАРАГИНОВАЯ КИСЛОТА. Одним из методов получения L-аспарагиновой кислоты является экстракция из белкового гидролизата, однако экономически более выгодным оказался синтез клетками Escherichia coli из фумаровой кислоты в присутствии аммиака. Реакцию осуществляет фермент аспартаза, находящаяся в клетках микроорганизма. Как правило, для выращивания клеток используют реактор, в котором бактерии иммобилизованы на κ- каррагинане или полиакриламиде. Выход продукта в такой системе достигает 140 г/(л ч), а срок службы биокатализатора на основе иммобилизованных клеток составляет два года. Использование сублимированных клеток промышленных штаммов позволяет получать до 166 г L-аспарагиновой кислоты с литра клеточной культуры. В лабораторных условиях удалось получить штамм E. coli с плазмидой, несущей ген аспартазы (aspA). В таком штамме выход L-аспарагиновой кислоты увеличивается в 30 раз.

L-ФЕНИЛАЛАНИН. Традиционно производство L-фе- нилаланина осуществлялось в ферментативных реакторах на доступном сырье. В последнее время в связи с развитием молекулярно-биологических методов, позволяющих получать генетически модифицированные штаммы-суперпродуценты, все шире используют ферментацию. Распространение ферментативных методов объясняется доступностью и невысокой стоимостью синтетического сырья, а также выгодным соотношением между производственными площадями, временными затратами и выходом продукта. Для производства L-фенилаланина наиболее выгодным оказалось использование биореактора, в котором в присутствии аммиака происходит аминирование коричной кислоты под действием фермента фенилаланинаммиаклиазы из Rhodotorula glutinis. В таком реакторе выход продукта достигает 50 г/л, а эффективность переработки сырья составляет 83%. Перспективным также считается метод расщепления D,L-5-бензилгидантоина ферментами L-гидантоина- зой и L-N-карбамоилазой, выделенными из Flavobacterium ammoniagenes. Для ферментации в биореакторах в современном производстве, как правило,

используют штаммы-суперпродуценты E. coli или коринебактерий. В этих организмах биосинтез L-фени- лаланина из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата протекает в несколько стадий. В качестве промежуточных соединений образуются шикимовая, префеновая и фенилпировиноградная кислоты, в диком штамме они предшественники L-триптофана и L-тирозина. Однако в промышленности используют мутантные ауксотрофные штаммы, в которых активность ключевых ферментов строго регулируется. Практически все гены, продукты которых участвуют в биосинтезе L-фенилаланина, к настоящему времени клонированы. Это позволяет получать новые штам- мы-суперпродуценты, применяя генно-инженерные методы. Так, выход L-фенилаланина в одном из рекомбинантных штаммов Brevibacterium fermentum

составляет 45 г на литр клеточной культуры. После завершения ферментации по воздушно-проточному способу клетки отделяют, а затем концентрируют культуральную жидкость ульрафильтрацией. Для окончательной очистки L-фенилаланина применяют ионообменную хроматографию или кристаллизацию. АСПАРТАМТМ. Для синтеза аспартама из L-аспараги- новой кислоты и L-фенилаланина необходимо сначала ввести в исходные молекулы пять защитных групп, а в конце синтеза их удалить. Такой метод значительно сложнее синтеза с использованием протеиназы. В обычных условиях протеолитические ферменты катализируют гидролиз пептидных связей, однако возможно сдвинуть равновесие в сторону образования пептидной связи. Так, в концентрированных растворах, содержащих L-аспарагиновую кислоту (в которой аминогруппа защищена бензилоксикарбонилом) и метиловый эфир L-фенилаланина, протеиназа катализирует образование малорастворимого пептида, который выпадает в осадок. Особенно важно, что в этой реакции принимает участие только α-карбоксильная группа L-аспарагиновой кислоты, так как изомер аспартама – метиловый эфир L-β-аспартил-L-фенилаланина – обладает сильно выраженным горьким вкусом. В промышленном производстве, как правило, используют иммобилизованную протеиназу термолизин, выделенную из Bacillus thermoproteolyticus. Этот фермент устойчив к высоким температурам и может осуществлять реакцию при 70 °С, что значительно повышает эффективность процесса (выход продукта достигает 30 г/л). Образовавшийся аспартам в значительной степени отделен от побочных продуктов, так что для окончательной очистки от примеси исходных веществ достаточно ионообменной хроматографии.

ВВЕДЕНИЕ. Как мы уже видели на примере L-лизина, L-аспарагиновой кислоты и L-фенилаланина, тот или иной энантиомер аминокислоты можно получить путем ферментативных превращений предшественников. В отличие от ферментации использование энантиоспецифичных ферментов позволяет синтезировать небелковые аминокислоты. Для этой цели наиболее широко используют гидролазы, селективно расщепляющие определенные энантиомеры в рацемате. В качестве примера можно привести эстеразы, аминоацилазы, амидазы и гидантоиназы. Недостаток метода заключается в необходимости удаления «неправильного» энантиомера из реакционной смеси, его рацемизации и повторного введения в реакцию. В другом методе используются реакции присоединения, катализируемые лиазами (например, оксинитрилазами), или окислительно-восстановитель- ные реакции, катализируемые оксидоредуктазами; в этих реакциях образуются только «правильные» энантиомеры.

ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ. Наиболее хорошо изучены и активно применяются в современных промышленных процессах аминоацилазы и гидантоиназы. Для осуществления гидролиза рацемата N-ациламинокислот используют иммобилизованную ацилазу, выделенную из Aspergillus oryzae или Baсillus thermoglucosidius. В реакции участвуют только L-энантиомеры, а N-ацил-D-аминокислоты, оставшиеся в реакционной смеси после кристаллизации L-аминокислот, подвергают термической рацемизации и снова вводят в реакцию. Таким способом ежегодно производят сотни тонн L-метионина, L-тирози- на, L-пролина и L-валина для медицинских нужд. Аналогичным образом можно получать и D-амино- кислоты, однако более выгодно использовать доступные предшественники аминокислот – гидантоины. После расщепления гидантоинов специфическими гидантоиназами образуются N-карбамоил- аминокислоты, которые в свою очередь могут быть превращены в D- или L-аминокислоты при помощи карбамоилаз. «Ложный» гидантоин прекращает ферментативную рацемизацию и в ходе оптимизированного путем генетических технологий ферментативного каскада приводит к количественному выходу абиогенных L- и D-аминокислот. Свойство «неправильного» гидантоина рацемизоваться при рН 8,5 легло в основу нового метода, перспективного для промышленного получения D-фенилглицина и 4-гидроксифенилглицина – важных предшественников полусинтетических пенициллинов ампициллина и амоксициллина.

ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЕ РЕАКЦИИ ПРИСОЕДИНЕНИЯ.

оксинитрилазы – ферменты из растительных тканей.

Внастоящее время R- и S-оксинитрилазы получены в виде рекомбинантных белков в клетках E. coli; при этом ген R-оксинитрилазы клонирован из маниока, а ген S-оксинитрилазы – из миндаля. Определена пространственная структура обоих ферментов и с помощью методов белковой инженерии предприняты попытки усовершенствовать ферменты для промышленного применения.

ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНО- ВИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ. На примере стереоселективного синтеза L-лейцина из α-оксоизокапроновой кислоты видно, что для восстановительного аминирования с помощью L-лейциндегидрогеназы из Bacil-

lus sp. кроме NH3 необходим NADH. Ввиду высокой стоимости кофермента необходимо создать систему его регенерации. Очень элегантно эта проблема решена в случае формиатдегидрогеназы из Candida boi-

dinii: CO2 – один из побочных продуктов реакции – сдвигает равновесие в сторону образования L-лейци- на. Использование NADH, связанного с полиэтиленгликолем (ПЭГ), позволяет получать до 600 000 молярных эквивалентов продукта из одного моля NADH.

Впромышленности восстановление NADH в окисли- тельно-восстановительных реакциях происходит на неизменяющемся коэнзиме в порционном режиме. Еще более интенсивно подобный процесс происходит

сучастием измененных (путем Protein Design или направленной эволюции) ферментов в генетически модифицированных микроорганизмах.