Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Скачать

Заказать новую работу

Внимание! Если размещение файла нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам

развития

Поиск биологически активных веществ

ВВЕДЕНИЕ. Поиск новых лекарств или химикатов для

в 96или 384-гнездных микротитровальных планше-

 

Тенденции

сельскохозяйственных нужд традиционно проводился

тах. Использование реакционных камер с объемом

ствуют в организме на определенный белок (или бел-

НЫХ ВЕЩЕСТВ. Несмотря на то что пространственные

 

методом проб и ошибок. Естественно-научные знания

~10–9 л на основе травленых кремниевых плат в со-

 

и новые технологии позволяют сделать этот поиск

четании с конфокальной лазерной спектроскопией

 

более рациональным. В основе такого подхода лежит

позволяют провести более 10 000 измерений в день.

 

идея о том, что биологически активные вещества дей-

РАЦИОНАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВ-

 

ки), называемые мишенями. В роли мишеней могут

структуры большинства белков-мишеней неизвест-

 

выступать ферменты, рецепторы, белки ионных кана-

ны, делаются попытки поиска сайтов связывания ми-

 

лов, в случае растений – белки, участвующие в фото-

шеней с биологически активными веществами. Для

 

синтезе. Анализ генома и применение методов

этого исследуют взаимодействие мишеней с различ-

 

протеомики позволяют значительно эффективнее

ными синтетическими аналогами природных субстра-

 

проводить поиск мишеней. Методами генетической

тов (QSAR – quantative structure – activity relations-

 

инженерии можно выделить эти белки, а затем изу-

hip). Полученные данные помогают изучать структуру

 

чить их взаимодействие с природными и синтетиче-

биологически активного вещества и усовершенство-

 

скими веществами. На основе полученных данных о

вать его в соответствии с поставленными целями

 

структуре действующего вещества в дальнейшем воз-

(drug design).

 

можно создание модифицированных соединений, об-

ПЕРСПЕКТИВЫ. На сегодняшний день из 50 000 ис-

 

ладающих определенной биологической активностью

следованных соединений лишь одно доходит до ста-

 

и некоторыми дополнительными свойствами. Скриниг

дии лекарственного препарата. В год в мире появля-

 

с применением методов химической комбинаторики и

ется около 30 новых фармацевтических продуктов.

 

современных биохимических данных позволяет полу-

Специалисты в области фармакологии надеются, что

 

чать новые лекарственные вещества.

с применением направленного скрининга это число

 

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ПОЛУЧЕНИЕ МИШЕНЕЙ. Несмот-

значительно возрастет. Анализ связанных с патоло-

 

ря на значительный прогресс биотехнологии в пос-

гией полиморфизмов должен выявить возможные

 

ледние десятилетия, идентификация мишеней, в осо-

индивидуальные отклонения в структуре гена-мише-

 

бенности в случае полигенных заболеваний, остается

ни, вызывающие те или иные проявления заболева-

 

весьма сложной задачей. Исследование генофонда

ния. Эта информация поможет устанавливать диаг-

 

замкнутых популяций, например в Исландии или Тас-

ноз на ранних стадиях заболевания и подбирать

 

мании, и изучение геномов больных в этих популя-

лекарственные средства, наиболее подходящие для

 

циях способствовали определенному прогрессу в

каждого конкретного пациента (фармакогеномика).

 

этой области. Если удалось установить связь между

 

 

дефектом фермента, ионного канала или рецептора и

 

 

проявлениями заболевания, на следующем этапе по-

 

 

лучают лабораторное животное, в котором «подозре-

 

 

ваемый» ген выключен, например, с помощью анти-

 

 

смысловой РНК. К примеру, если G-связанный

 

 

рецептор распознается как мишень, он может быть

 

 

локализован в мембране фибробластов мыши. В ка-

 

 

честве цитоплазматического репортера используют

 

 

экспрессию люциферазу светляка. Как только лиганд

 

 

связывается с рецептором, происходит передача сиг-

 

 

нала путем повышения концентрации цАМФ в цито-

 

 

плазме, что приводит к развитию доступного для ко-

 

 

личественной оценки люминесцентного сигнала при

 

 

наличии субстрата люциферазы – люциферина.

 

 

МАСШТАБНЫЙ СКРИНИНГ. Наиболее распространен-

 

 

ный современный метод масштабного скрининга за-

 

 

ключается в исследовании действия веществ из об-

 

 

ширных библиотек химических соединений (более

 

 

100 000 соединений) на мишень. Получение библи-

 

 

отек методом химической комбинаторики позволяет

 

270

практически безгранично увеличить количество ве-

 

ществ в библиотеке. Такого рода измерения проводят

 

Скрининг биологически активных веществ

 

Природные вещества,

Биологические мишени, например,

Литературные данные,

пептиды, синтетические

из анализа генома или протеома

вещества-аналоги

вещества, комбинаторная

 

 

 

химия

 

 

 

 

Экспериментальная модель,

 

 

масштабный скрининг

 

 

 

Основная структура

Фармацевтические

 

 

требования,

 

 

активного вещества

 

 

побочные явления

 

 

 

 

Концепция эксперимента, синтеза

 

Биологическая проверка

 

 

Определение структуры,

 

 

компьютерный дизайн

 

 

 

 

Установление связи между структурой

 

 

и действием вещества, QSAR

 

Связь с интересующими свойствами

Выбранное вещество

Лекарственный препарат

Мишени

 

 

 

 

Количество

Пример

Применение

 

в организме человека

 

 

Ферменты

8 000

Ацетилхолинэстераза

Болезнь Альцгеймера

Рецепторы

15 000

Рецептор серотонина

Шизофрения

Ионные каналы

3 000

Са-канал

Болезни старческого возраста

 

 

 

 

Масштабный скрининг

Клетки-мишени на микротитровальном

планшете

СО2-инкубатор*

Добавление веществ–кандидатов

и реагентов

Анализатор

Автоматизированное нанесение проб

Отмывка планшета

Центрифугирование планшета

Автоматизированное управление

процессом

* Необходим только при использовании

в качестве мишеней культур клеток

человека или животных

Рациональный дизайн биологически активных веществ

 

 

 

Трехмерная

 

Предложенный

 

 

 

Синтетические

 

 

 

Биологически

 

 

 

 

 

 

структура или

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

структурная модель

 

 

 

лиганд

 

 

 

соединения

 

 

 

 

активен?

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Отходы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Определение структуры

Химический синтез лигандов

 

 

 

Цикл 1

 

 

 

 

 

 

белка или создание модели

Биологический тест

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Цикл 2

и т. д.:

 

 

Дизайн лигандов

Определение структуры или

 

 

 

 

 

 

 

 

оптимизация

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

создание модели мишени и лиганда

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

271

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Тенденции развития

272

Протеомика

ВВЕДЕНИЕ. Термин «протеомика», предложенный

в1995 г., отражает неразрывную связь между геномом и белковым составом клетки. Считается, что у высших организмов из одного генного транскрипта

врезультате сплайсинга и посттрансляционных изменений образуется примерно 10 белков. Протеомика занимается изучением экспрессии, функции и взаимодействия генных продуктов на основе анализа генома (функциональная геномика).

МЕТОДЫ. Основным методом протеомики является выделение и анализ большого числа белков. Например, протеом Escherichia coli состоит из 4000 белков. Решающее значение имеет способ выделения белка: так, мембранные и растворимые белки выделяют по-разному. В случае эукариотических организмов обычно используют экстракты из клеток различных тканей: так доказывают связь белкового состава клетки с ее тканевой принадлежностью. Наибольшее распространение для изучения характера экспрессии белков получил метод двумерного электрофореза,

вкотором в одном направлении происходит разделение белков в соответствии с их изоэлектрической точкой, а во втором – в сооветствии с молекулярной массой. При правильно подобранном диапазоне рН разрешение метода может быть достаточно высоким. Полуколичественную оценку результатов разделения в двумерном электрофорезе на ПААГ получают после окрашивания белков и сканирования геля с помощью специальных компьютерных программ. Самая совершенная система позволяет анализировать несколько сотен гелей в неделю. Особенно сложные задачи протеомики: идентификация белков, образующихся в очень малых количествах (10–1000 копий на клетку), количественная оценка содержания таких белков, установление взаимосвязи между геном и белком, подвергнутым значительным модификациям. Один из путей количественной оценки содержания белка известной структуры – использование библиотек антител. Однако часто перед исследователем стоит задача идентификации белка с неизвестной структурой. Современные технологии позволяют определить N-концевую (неацилированную) последовательность белка, если в пробе содержится более 1 мг белка. На следующем этапе проводят сравнение полученной концевой последовательности аминокислот (а с учетом вырожденности генетического кода – и участка гена) с геномной библиотекой. Для анализа многих белков, экспрессирующихся в небольших количествах, лучше всего подходит метод масс-спек- трометрии. Масс-спектрометрия MALDI-TOF (matrixassisted laser-desorption-ionization-time-of-light) позволяет определить молекулярную массу исследуемого белка лишь приблизительно. Для более точной информации о размере белка пробу в двумерном

электирофорезе на ПААГ обрабатывают трипсином и определяют массы полученных фрагментов белка. Сравнение полученных таким образом результатов с компьютерными данными по «виртуальной» обработке трипсином белков из библиотеки позволяет сделать выводы о молекулярной массе исследуемого белка. Очевидно, что такой метод можно использовать только в том случае, если геном организма, из которого выделен белок, полностью секвенирован и протеом достаточно хорошо охарактеризован. Если же подробная информация о структуре генома не доступна, используют масс-спектрометрию ESI-TOF (electrospray- time-of-light). Для этого создаются белковые маркеры PTS (protein sequence tags), помогающие идентифицировать неизученный белок с помощью белковых библиотек. Метод позволяет идентифицировать белок при содержании нескольких сотен фемтомолей, следовательно, надо чтобы он синтезировался в клетке в количестве сотен тысяч копий.

ПРИМЕНЕНИЕ. Методы протеомики позволяют изучать специфические для клетки или индуцированные внешними воздействиями изменения в характере экспрессии белков, например: 1) различия в экспрессии генов Escherichia coli при росте на глюкозе или на молочной кислоте; 2) экспрессия генов в β-клетках поджелудочной железы у здоровых людей и у больных диабетом; 3) токсическое действие лекарственных препаратов на экспрессию генов, например, в клетках печени. Таким способом часто удается найти «белковые маркеры» определенных заболеваний. Методы протеомики позволяют выяснить функцию белка в клетке. Для этого создаются протеомные карты клеток и моделируются «клеточные фабрики», учитывающие сложные взаимосвязи между белковыми комплексами. Для изучения функции белка в клетке полезным оказывается мечение с помощью tag-последовательности, которая позволяет проводить аффинную очистку белка для масс-спект- рометрии и окончательной идентификации.

Один геном – различные протеомы

 

 

 

 

Геномная библиотека

Геном

 

 

 

Библиотека мРНК

Протеом 1

Протеом 2

Протеом 3

Протеом 4

 

Протеомная библиотека

 

 

 

 

Белковая библиотека

 

Анализ белка

 

 

• Определение N-концевых

• Масс-спектрометрия

 

аминокислот

 

• Посттрансляционные

 

• Аминокислотный состав

модификации

 

Литературные,

• Расщепление

 

• Иммуноанализ (вестерн-блот,

биологические,

протеиназами

 

белковые микрочипы)

медицинские данные

 

 

 

 

Высший организм с 30 000 генов содержит вплоть до 1 000 000 белков,

 

 

уровень экспрессии которых зависит от типа клеток (10 000 белков на каждый тип клеток)

 

Методы протеомного анализа

 

 

 

 

 

Приготовление пробы

 

Электроблоттинг

Разделение белков

Обработка

 

 

 

 

трипсином в геле

 

 

 

Интактные белки

 

Пептидные фрагменты

Анализ нуклео-

 

Без

Разделение

 

разделения

методами

тидной последо-

 

 

 

ЖХ* и КЭ**

вательности

 

 

 

 

 

Анализ амино-

 

 

Анализ нук-

кислотной пос-

Методы масс-спектрометрии:

 

леотидной

ледовательности

 

последова-

 

MALDI-TOF, ESI-TOF и др.

 

тельности

 

Банки данных ДНК и белков

 

* ЖХ – жидкостная хроматография. ** КЭ – капиллярный электрофорез.

 

Двумерный электрофорез белков

Применение

 

пекарских дрожжей

 

 

Обмен веществ

100 кДа

 

 

 

 

Взаимо-

 

 

 

масса

 

 

действия

 

Лекарства

Температура

 

 

Молекулярная

 

 

 

Химикаты

Стресс

 

 

 

 

 

 

 

 

Взаимо-

 

 

 

действие

 

 

 

с другими

6 кДа

 

 

клеткам

 

 

Экспрессия, специфическая

 

 

Геном

Изоэлектрическая точка

для данного типа клеток

 

273

 

 

 

Тенденции развития

Биоинформатика*

ВВЕДЕНИЕ. Стремительное развитие молекулярной

(по состоянию на конец 2005 г.). За год количество

биологии в последние десятилетия было бы невоз-

проанализированных структур увеличивается пример-

можно без прогресса компьютерных и телекоммуни-

но на 4000. Данные собраны в крупнейших банках

кационных технологий, позволяющих сохранять, упо-

белковых структур: PDB (Protein Data Bank) и Swiss-

рядочивать и проводить сравнение огромных объемов

Prot. Интернет позволяет сравнивать любую получен-

информации. Интернет, созданный в 1970 г. для уз-

ную последовательность ДНК или аминокислот с уже

ких научных целей, за последние годы стал «мировой

имеющимися последовательностями в банке данных.

сетью», насчитывающей более 40 млн сайтов и более

Если уровень гомологии между полученной последо-

100 млн пользователей по всему миру (эти числа уд-

вательностью и последовательностью из банка дан-

ваиваются каждый год). Интернет сделал возможным

ных превышает 30%, можно построить модель про-

обмен научными данными, что способствует большей

странственной организации изучаемого пептида.

продуктивности научной работы. Под термином «био-

Банки белковых структур (SCOP, CATH) содержат

информатика» принято понимать совокупность ин-

информацию об «архитектурных типах» белков. Нес-

формации о структуре ДНК и белков (геномы и проте-

мотря на то что теоретическое число аминокислотных

омы), расширяющуюся до представления о полных

последовательностей в белках очень большое (напри-

геномах и протеомах организмов и их функции.

мер, из 300 аминокислот можно составить 20300 бел-

ИНФОРМАЦИЯ О НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ-

ков), в природе белков не так много. Вторичная бел-

НОСТЯХ ГЕНОМОВ. Широкое распространение мето-

ковая структура (α-спирали и β-слои) накладывает

дов секвенирования ДНК и высокая скорость анализа

определенные структурные ограничения, создавая и

привели к тому, что объемы информации в междуна-

организуя белковую молекулу по модульному типу,

родных банках данных ДНК каждые два года увеличи-

поэтому число вариантов из вышеуказанного числа

ваются более чем в 10 раз. Если в 1998 г. объем ми-

аминокислот уменьшается и составляет около 1500.

ровых банков ДНК составлял 2 млрд оснований, то в

В рамках структурной геномики изучаются возможно-

2004 г. эта цифра превысила 45 млрд. Благодаря

сти предсказания пространственной структуры белков

осуществлению большого числа проектов по анализу

на основе данных геномного анализа.

геномов, количество информации растет очень быст-

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ. Для многих подробно

рыми темпами. Вся полученная к настоящему момен-

изученных белков, таких как ацетилхолинэстераза,

ту информация о структуре генов объединена в трех

протеиназы, белки ионных каналов, рецепторы и им-

«центральных» банках данных, созданных в США, Япо-

муномодуляторы, использование баз данных из ин-

нии и Англии. Использование интернета позволяет

тернета позволяет сравнивать структуру и функцию

исследователю сравнивать результаты секвенирова-

белков из разных организмов, а также проводить

ния с уже имеющимися в банках ДНК последова-

анализ гомологий. Конечной целью таких исследова-

тельностями с целью выявления гомологии или

ний является создание общей картины обмена

идентичности. Самые большие банки информации о

веществ в организме на основе информации о его от-

структуре белков – PIR (Protein Information Re-

дельных этапах (электронтранспортная цепь, глико-

source) в Вашингтоне и банк данных SwissProt; они

лиз и др.).

содержат информацию о 300 000 и 200 000 белках

 

соответственно (на конец 2004 г.).

 

СТРУКТУРНАЯ ИНФОРМАЦИЯ. По сравнению с секве-

 

нированием геномов темпы получения информации о

 

структуре белков не такие впечатляющие. Это связано

 

с весьма трудоемкой процедурой определения струк-

 

туры белка: получение кристалла и рентгеноструктур-

 

ный анализ комплекса белка с металлом – техниче-

 

ски очень сложные задачи; особые затруднения

 

вызывает анализ крупных белковых комплексов или

 

мембранных белков. Двумерный ЯМР-анализ позво-

 

ляет определить структуру только растворимых бел-

 

ков размером ~30 кДа, однако, несмотря на строгие

 

ограничения, этим методом получена информация

 

о пространственной структуре более 32 000 белков

 

* Леск А. Введение в биоинформатику / А. Леск; пер. с англ. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. – 318 с.: ил., 274 [4] с цв. вкл.

Смотрите также:

«ДОХОДЫ, РАСХОДЫ И ПРИБЫЛЬ КОММЕРЧЕСКОГО БАНКА.»
«ДОХОДЫ, РАСХОДЫ И ПРИБЫЛЬ КОММЕРЧЕСКОГО БАНКА.»
Значение, сущность и содержание социально — педагогической деятельности в организации для детей-сирот и детей, оставшихся без попечения родителей
Проактивные методы PR-деятельности российских авиационных компаний «Россия», «Азимут»
__RGR2
__RGR2
_10_Эмиль Золя для эл версии
_11_А. Франс для эл версии
_3 тема - Диффузия