Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

инженерии

Маркерные группы

ВВЕДЕНИЕ. Маркерные молекулы имеют важное зна-

чение в фундаментальных исследованиях и приклад-

генетической

ной биотехнологии. Их используют: 1) при гисто- и

цитохимическом изучении клеток; 2) при отборе не-

обходимых клеток в клеточном анализаторе; 3) для

визуализации комплексов, например, с ДНК или с

антителами; 4) в генетической инженерии – при кло-

нировании промоторов. Для мечения используют ра-

диоактивные изотопы, флуорофоры, ферменты, ди-

Методы

гоксигениновую

или биотин-стрептавидиновую

систему, а в качестве генетических маркеров исполь-

зуют гены β-галактозидазы, люциферазы или GFP

(зеленого флуоресцентного белка).

РАДИОАКТИВНОЕ

МЕЧЕНИЕ. Для радиоиммуного

анализа белки метят с помощью 131I или 35S, а де-

тектирование осуществляют на сцинтилляционном

счетчике. В генетической инженерии в ДНКили

РНК-зонды вводят 32Р-фосфатные группы, используя

ДНК-полимеразу I, фрагмент Клёнова или РНК-поли-

меразу. Результаты гибридизации меченых фрагмен-

тов наблюдают с помощью авторадиографа. Соблю-

дение техники безопасности при работе с

радиоактивными изотопами сопряжено с финансо-

выми затратами. Несмотря на это, радиоактивное

мечение чаще всего используется благодаря высокой

чувствительности методов детекции. Поиск новых

меток и подходящих быстрых методов детекции про-

должается

ФЛУОРОФОРЫ. Использование таких флуорофоров,

как флуоресцеин или родамин, позволяет обнаружи-

вать вещества в пикомолярных концентрациях. В ги-

сто- и цитохимических исследованиях особенно ши-

рокое применение находят меченные флуорофорами

антитела. В клеточном анализаторе FACS за одну ми-

нуту можно отделить до 1000 клеток, несущих флу-

оресцентный маркер. Примером использования этого

метода в клеточной биологии является разделение

различных типов Т- и В-клеток, имеющих на своей

поверхности специфические антитела. Другой при-

мер применения флуорофоров – поиск в смеси бак-

терий тех, чья 16S-рРНК гибридизуется со специфи-

ческим меченым зондом (FISH). Флуоресцентными

маркерами для ДНК являются SYBR-GreenTM и бро-

мистый этидий.

ФЕРМЕНТЫ. Преимущества ферментных меток об-

условлены их мощной каталитической активностью,

благодаря которой достигается высокая чувствитель-

ность при многократном усилении сигнала. Это важ-

но при проведении анализов. Часто в качестве мар-

керов используются кислая фосфатаза и

пероксидаза хрена. Реакции, катализируемые этими

ферментами, можно изучать электрохимическими

266

(биосенсоры), фотометрическим, а также особенно

чувствительным хемилюминесцентным или флуорес-

ВВЕДЕНИЕ. Среди более 15 000 известных заболева-

логичными клетками), а также методы прямого вве-

ний человека большинство (~90%) обусловлено на-

дения ДНК в клетки-мишени.

следственными или приобретенными генетическими

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПЫТАНИЙ В ГЕННОЙ ТЕРА-

нарушениями. До последнего времени такие болезни

ПИИ. Около 2/3 всех разработок в области генной те-

считались неизлечимыми, однако генная терапия от-

рапии направлены на терапию опухолей. Для этого

крывает новые возможности для борьбы с болезня-

используют гены, кодирующие супрессоры опухолей

ми. Например, уже осуществлено несколько удачных

(BRCA1 и p53), цитокины (IL-2), антигены гистосов-

попыток замены дефектных генов человека на нор-

местимости (HLA-B7) или так называемые «суицид-

мальные. К началу 2004 г. в почти 1000 медицин-

ные» гены или (достаточно часто – 14%) гены, коди-

ских проектах по генной терапии (из которых 2/3 вы-

рующие антитела к клеткам опухолей. Современные

полняются в США) участвовали уже тысячи человек.

методы терапии моногенных заболеваний касаются в

Официально разрешена только генная терапия сома-

основном тяжелого комбинированного иммунодефи-

тических клеток. Введение генетических изменений

цита (SCID, human severe combined immunodeficien-

в яйцеклетки или сперматозоиды человека запреще-

сy), обусловленного дефектом гена аденозиндезами-

но, так как это может привести к изменению наслед-

назы. Активно изучаются также возможности генной

ственного материала. Генная терапия может осу-

терапии муковисцидоза – болезни, возникающей в

ществляться в системе in vivo (т. е. генетический

результате повреждения трансмембранного белка.

материал претерпевает изменения непосредственно

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ EX VIVO. Этот метод получил распро-

в организме пациента) или в системе ex vivo, когда

странение, после того как впервые удалось осущест-

трансформация и размножение клеток проводятся

вить трансплантацию клеток костного мозга. В генной

вне организма, а затем клетки вновь вводятся в орга-

терапии гематопоэтические клетки костного мозга

низм пациента.

имеют особое значение, так как они являются предше-

ОБЩИЙ ПРИНЦИП. Генетические причины большин-

ственниками всех клеток крови и клеток иммунной си-

ства заболеваний остаются до сих пор невыясненны-

стемы. Таким образом, если в этих еще недифферен-

ми. Однако даже при моногенных заболеваниях,

цированных клетках осуществить вне организма замену

молекулярная причина которых достоверно установ-

дефектного гена на здоровый и вернуть их в организм,

лена, генная терапия часто затруднена, прежде всего

клетки, образующиеся из них в результате дифферен-

из-за защитных реакций организма, а также внутри-

цировки, будут нести здоровый ген. Однако культивиро-

клеточных механизмов контроля, направленных про-

вание недифференцированных стволовых клеток

тив чужеродных нуклеиновых кислот. Все разнообра-

взрослого организма – очень сложная задача, а этиче-

зие вариантов генной терапии сводится к трем

ская сторона использования стволовых клеток эмбрио-

основополагающим стратегическим подходам:

нов вызывает бурные общественные дискуссии.

1) рекомбинация дефектного гена с введенной кДНК,

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ IN VIVO. Из многочисленных попы-

приводящая к встраиванию «здоровой» копии гена

ток замены дефектного гена на здоровый путем вве-

вместо дефектной; 2) выключение гена посредством

дения ДНК непосредственно в клетки организма не-

введения антисмысловой РНК; 3) репарация дефект-

которые прошли успешно. Иногда в результате

ного гена с применением химерных конструкций из

осуществления генной терапии in vivo наблюдались

ДНК и РНК. В качестве векторов для введения ДНК в

значительные улучшения клинической картины забо-

клетки человека используют, как правило, векторы

левания: так, четверо из пятерых детей, страдающих

на основе генома ретровирусов (25%), а также аде-

SCID-X1, после проведения курса генной терапии

новирусов (28%). 16% всех экспериментов проведе-

смогли покинуть больницу и вернуться домой. Одна-

ны с использованием несвязанной или плазмидной

ко осуществление направленной генной терапии оп-

ДНК. В 13% случаев используют катионные липосо-

ределенных органов или типов клеток пока остается

мы (липофекция в 9% случаев), которые позволяют

неразрешенной проблемой.

доставлять в клетки человека очень крупные фраг-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Теоретические и лабораторные иссле-

менты ДНК. Липосомы в виде аэрозоля вводят в ор-

дования показали, что генная терапия моногенных

ганизм человека через дыхательные пути, а затем

заболеваний человека возможна, однако все еще ос-

они попадают в клетки путем эндоцитоза. Векторы на

тается множество технических проблем. После того

основе вирусных геномов вводят внутримышечно или

как спонтанное размножение аденовируса, использо-

непосредственно в клетки опухоли. Описаны способы

ванного в качестве вектора для генной терапии, при-

трансплантации собственных клеток костного мозга

вело к смерти пациента в США, контроль генной те-

после их генетической модификации (терапия ауто-

рапии был значительно ужесточен.