Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Типы обмена веществ

Аутотрофы

Гетеротрофы

Микробиоло-

Этанол

гическое

Ацетон

выщелачива-

и бутанол

ние руд

Анаэробная

переработка

активного ила

Трансгенные

Лимонная кислота

растения

Аминокислоты

Антибиотики

Нитрифи-

Ферменты

кация

Витамины и т. д.

Варианты цикла

лимонной кислоты

Saccharo-

Bacillus

Haemo-

Treponema

myces

subtilis

philus

pallidum

cerevisiae

influenzae

Пируват

Лимонная кислота

Оксалоацетат

Реакции обмена веществ, используемые в биотехнологии

Гликоген,

крахмал

Гексозофосфаты

Пентозофосфаты

Тетрозофосфаты

Триозофосфаты

Шикимовая

кислота

Серин

Фосфоглицерат

Хоризмовая

кислота

Цистеин

Фосфоенолпируват

Лейцин

Триптофан

Тирозин

Валин

α-Амино-

адипат

Ацетил-КоА

Оксалоацетат

Цитрат

Аспартат

Сукцинат

Аконитат

α-Оксо-

глутарат

Изопреноиды

Жирные

Поликетиды

кислоты

Ацетоацетил-КоА

Цикл лимонной кислоты

Гликолиз

277

развития

Метаболомика и метаболическая инженерия

ВВЕДЕНИЕ. Знания о процессах обмена веществ,

тической инженерии уменьшают количество копий

Тенденции

их организации и способах регуляции в совокупности с

гена этого фермента в геноме и наблюдают за коли-

ВЭЖХ–МС или ЯМР-спектроскопии высокого разре-

тех немногих случаях, когда известна полная после-

терного моделирования позволяют следить за судьбой

циях в клетках. Другой подход к изучению регуляции

конкретного вещества в клетке. По результатам ко-

заключается в математическом моделировании ди-

личественного

анализа метаболитов методами

намики этих процессов. Этот подход примененим в

шения (методы метаболоники и метабономики) можно

довательность реакций образования продукта со все-

направленно изменять методами генетической инже-

ми побочными процессами. Для проверки математи-

нерии обмен веществ, механизмы регуляции и сигна-

ческой модели определяют количества метаболитов,

лизации у растерий и микроорганизмов, например, с

образующихся на разных стадиях. С этой целью кле-

целью повышения продуктивности или расширения

точную культуру, достигшую стационарного состоя-

спектра субстратов (метаболическая инженерия).

ния, активируют, например, путем добавления глюко-

ИЗУЧЕНИЕ ПОТОКОВ ВЕЩЕСТВ ПРИ МЕТАБОЛИЗМЕ.

зы в среду роста и изучают ответ системы, измеряя

По современным представлениям, обмен веществ

концентрации компонентов клеточного пула.

может быть представлен системой уравнений равно-

ПРИМЕНЕНИЕ. Благодаря относительно простой орга-

весных реакций, записанных с соблюдением стехио-

низации микроорганизмы изучены значительно луч-

метрических соотношений реагирующих веществ. Для

ше, поэтому методы «метаболической инженерии»

некоторых веществ таким образом удается описать

пока применимы исключительно к этим объектам. Из-

все их превращения в клетке. При этом для достовер-

менения в обмен веществ микроорганизмов вносят с

ности картины необходимо определить потоки ве-

различными целями: а) расширение спектра веществ,

ществ через цитоплазматическую мембрану (поступа-

которые могут подвергаться микробной деградации

ющие субстраты

образующиеся продукты). Однако

(экологическая задача); б) увеличение интенсивности

для большинства веществ последовательность пре-

образования полезных для человека метаболитов.

вращений в клетке до сих пор окончательно не выяс-

Так, в результате клонирования генов лактозного опе-

нена. Важная информация, особенно когда предпола-

рона в Zymomonas mobilis (промышленный продуцент

гается существование нескольких путей обмена,

этанола) и Corynebacterium glutamicum (продуцент

может быть получена из результатов измерения фер-

глутаминовой кислоты и лизина) эти микроорганизмы

ментативной активности, изучения профиля экспрес-

приобрели способность использовать молочную сыво-

сии белков с помощью микрочипов и наблюдения за

ротку в качестве источника углерода. В результате

судьбой меченых соединений в клетке. При этом ис-

генно-инженерных манипуляций были получены клет-

пользуется, как правило, мечение радиоактивными и

ки штамма Pseudomonas sp. В13, способные разла-

стабильными изотопами (13С, 14C, 15N, 32P и 35S). Ме-

гать хлорсодержащие и метилированные ароматиче-

ченые соединения содержатся в среде роста, и за их

ские соединения. В промышленном производстве

попаданием в клетку и дальнейшими превращениями

первичных (аминокислоты, этанол и другие спирты,

наблюдают методами ядерного магнитного резонанса

биополимеры, витамины) и вторичных метаболитов

(ЯМР) или масс-спектрометрии (МС). Результаты та-

(антибиотики) широко используются рекомбинантные

кого анализа с помощью изотопомеров (изотопы–

микроорганизмы, полученные методами метаболиче-

изомеры) и данные о биохимии процессов в некото-

ской инженерии. Например, по сравнению с дикими

рых относительно простых случаях позволили

клетками выход лизина увеличивается на 50% на

составить математическую модель разветвленного

штаммах С. glutamicum, которые удалось получить

пути обмена или даже полную картину превращений

после изучения конкурирующих реакций путей био-

вещества в клетке.

синтеза и секреции лизина и внесения соответствую-

РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Для обнаружения фер-

щих изменений в геном.

мента, свойства которого определяют самую мед-

ленную реакцию в процессе образования продукта,

необходимо выстроить иерархию регуляторных взаи-

модействий, т. е. выяснить роль каждого фермента в

регуляции процессов. Как правило, на активность

фермента в клетке влияют несколько факторов (ве-

ществ, ферментов), и каждый фермент в свою оче-

редь оказывает регуляторное действие на другие

278

ферменты. Для того чтобы установить роль фермен-

та в этих сложных взаимодействиях, методами гене-

Углеводы

Аминокислоты,

нуклеотиды

Жиры

Белки

Катаболизм

Анаболизм

Рост

Триозо-,

Пируват,

Белки,

тетрозо-,

ацетил-КоА,

нуклеиновые кислоты,

пентозо-,

α-оксоглутарат,

сложные липиды,

гексозо-

сукцинил-КоА,

мембрана,

фосфаты,

оксалоацетат

клеточная стенка,

фосфоенол-

органеллы

пируват

Поток веществ в процессе образования лизина

Анализ метаболитов методом ЯМР

Glu

= Глюкоза

Контейнер

PEP

= Фосфоенол-

с магнитом

пируват

Крышка

Pyr

= Пируват

Рибулозо-5Р

AcСoA = Ацетил-КоА

OA

= Оксалоацетат

G6P

= Глюкозо-6-

Биореактор

фосфат

F6P

= Фруктозо-6-

фосфат

ной кислоты

Стеклянная

активирован,

подложка

глиоксилат-

ный цикл

блокирован

Трубка

Цикл лимон-

для ЯМР

Изоцитрат

(10 мм)

ной кислоты

блокирован,

Малат

глиоксилат-

Резервуар

ный цикл

для проб

Лизин

Сукцинат

активирован

Анализ мутантов

Дикий тип

Удельная

скорость

роста μ, ч–1

Выход

лизина,

г/г глюкозы

279