Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

рекомбинантного tPA выбирают клетки мышей или клеточные линии СНО, а образующийся белок очищают различными способами, включающими осаждение в кислой среде, а также ионообменную, гидрофобную и аффинную хроматографию. Мутанты производят фермент с искусственно измененным сайтом гликозирирования и четырьмя аминокислотными заменами (TNK-tPATM), который прочно связывается с фибрином и имеет более продолжительное время полураспада в сыворотке. В этой связи вместо использования инфузии можно провести однократное введение. Мутанты E. coli с нарушенной функцией гликозилирования синтезируют фермент, лишенный петлевого-1 и eGF-доменов (RepilysinTM), однако его выделение из телец включения оказывается затруднительным. По сравнению с tPA время пребывания этого белка в сыворотке в 3–4 раза больше, а аллергенные свойства выражены слабее. tPA также секретируется с молоком трансгенных коз и овец, которые трансформированы вектором, содержащим фрагмент tPA-кДНК под промотором лактальбумина. Белок tPA, кроме того, получают из молока трансгенных коз и овец, в которых ген tPA клонирован за промотором лактальбумина. Для контроля однородности полученного таким способом tPA требуется применение специальных аналитических методов.

ДРУГИЕ ТРОМБОЛИТИКИ. Урокиназа – сериновая протеиназа; в виде проурокиназы присутствует в сыворотке крови и в моче. Подобно tPA, урокиназа гидролизует плазминоген с образованием плазмина. Обнаружены две формы белка с MR 54 и 30: белок меньшего размера образуется из большего при автолизе, и обе формы обладают биологической активностью. Урокиназу выделяют из мочи, культуры клеток почек человека или в виде рекомбинантного продукта из клеток E. coli. Стрептокиназа образуется в различных гемолитических стрептококках. Этот белок не обладает каталитической активностью, однако вызывает конформационные изменения в молекуле плазминогена, что приводит к автолизу с образованием плазмина. Стрептокиназу получают из культур стрептококков методами хроматографии. Применение других, более дешевых способов очистки белка, связано с риском возникновения сильных иммунных реакций.

Биотехнология в медицине

132

Ингибиторы ферментов

ВВЕДЕНИЕ. В современной медицине широко используются ингибиторы ферментов. Например, ингибитор протеаз апротинин, получаемый из отходов при переработке мяса, применяют для терапии шоковых состояний, а рекомбинантный α1-антитрипсин в будущем, возможно, найдет применение для лечения эмфиземы легких. Множество микробных ингибиторов протеаз (лейпептины, пепстатин, антипаин, химостатин, эластиналь) пока не нашли применения

вмедицине, однако активно используются в фундаментальных исследованиях. Ингибитор α-гликозидазы акарбозу успешно применяют при лечении диабета, а ингибитор панкреатической липазы тетрагидролипстатин – при лечении ожирения.

АПРОТИНИН – полипептид, состоящий из 58 амино-

кислот (МR 6511), ингибирует такие протеазы как трипсин, химотрипсин и плазмин. Другое название апротинина – панкреатический ингибитор трипсина. Константа ингибирования трипсина с помощью апротинина составляет 10–11 М. Лекарственные препараты, содержащие апротинин (Trasylol®), применяют для лечения панкреатитов, при трансплантации органов, а также при сильных кровотечениях и шоковых состояниях. Перспективным считается применение апротинина в работе с культурами животных клеток:

вэтом случае апротинин препятствует протеолитическому расщеплению рекомбинантных белков. Апротинин экстрагируют из поджелудочной железы или легких крупного рогатого скота, а затем очищают хроматографическими методами. Белок негликозилирован, следовательно, может быть получен как рекомбинантный продукт в бактериальных клетках, в том числе в Escherichia coli.

α1-АНТИТРИПСИН (α-АТ). Этот гликопротеин (МR 54 кДа), закодированный в 14-й хромосоме человека, образуется в печени и при концентрации ~2 г/л ингибирует более 90% всей ферментативной

активности, проявляющейся во фракции α1-глобули- нов сыворотки крови. Одним из субстратов α1-анти- трипсина является эластаза, образующаяся в нейтрофильных гранулоцитах и осуществляющая протеолитическое расщепление эластина – основного структурного компонента легочной ткани. Таким образом, α-АТ предотвращает разрушение ткани легких. В Северной Европе у населения нередко встречается генетический дефект α-АТ – замена Lys53 на Glu (такой α-АТ называется α-АТ Z-типа). В случае такой мутации значительно снижается уровень секреции α-АТ из клеток печени, и его содержание в крови составляет лишь 15% нормы. Наличие α-антитрипсина Z-типа особенно опасно для курящих, так как в табаке содержатся вещества, окисляющие Met358 α-АТ, который играет важную роль при ингибировании эластазы. Под действием эластазы в легочной ткани

развиваются эмфиземы, что в большинстве случаев вызывает удушье и смерть. Внутривенное введение ингибиторов эластазы (около 200 г в год) позволяет замедлить развитие болезни. Основным источником α-АТ является кровь доноров. Для получения рекомбинантного ингибитора предпочитают клетки Saccharomyces cerevisiae, так как биологически активный α-АТ должен быть гликозилирован, следовательно, продукт, образующийся в клетках E. coli, оказывается неактивным. Экономически выгодна экспрессия рекомбинантного α-АТ, слитого с β-лактальбумином, в молочных железах овцы.

АКАРБОЗА (Glucobay®) – это псевдотетрасахарид, получаемый из культур Actinoplanes utahensis. Акарбоза является конкурентным ингибитором α-глюко- зидаз. Под действием акарбозы в желудочно-кишеч- ном тракте снижается уровень глюкозы, поэтому ее применяют в качестве антидиабетического средства. Производство акарбозы основано на микробной ферментации. К настоящему времени клонированы некоторые гены, участвующие в биосинтезе акарбозы.

ЛИПСТАТИН (ЛИПОСТАТИН) – липофильный эфир, содержащий β-лактоновое кольцо и боковую цепь, несущую N-формил-L-лейцин. Это вещество получают из культуры Streptomyces toxytricinii. В результате каталитического гидрирования из липстатина образуется тетрагидролипстатин (Xenical®). Оба вещества (липстатин и тетрагидролипстатин) ковалентно связываются с остатком серина в активном центре липаз. При оральном применении этих веществ в желудочно-кишечном тракте происходит ингибирование панкреатической липазы, осуществляющей гидролиз триглицеридов, а переваривание свободных жирных кислот не нарушается. По этой причине при ожирении назначают прием тетрагидролипстатина. Липстатин и тетрагидролипстатин получают химическим синтезом или ферментацией в клетках Streptomyces toxytricinii с последующей экстракцией и хроматографической очисткой. Объем рынка в США составляет около 500 млн долл. (2004 г.).

Внастоящее время изучаются возможности их терапевтического применения.

КЛЕТКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ. В костном мозге продуцируются гематопоэтические стволовые клетки, которые затем дифференцируются в миелоидные или лимфатические стволовые клетки. Миелоидные стволовые клетки дают начало тромбоцитам, гранулоцитам и макрофагам, а из лимфатических стволовых клеток образуются лимфоциты, поступающие в кровь

илимфатическую систему. В организме здорового взрослого человека присутствует около 1012 «наивных» лимфоцитов, которые еще не вступали в контакт с антигенами. При взаимодействии таких клеток с антигеном (или под действием сигнальных веществ) происходит активация лимфоцитов, и путем селективного клонирования образуется большое количество дочерних клеток, специфических к этому антигену. Лимфоциты продложают дифференцировку до В-кле- ток и Т-лимфоцитов. Созревшие в костном мозге В-клетки поступают в селезенку или лимфатические узлы и в ответ на действие антигена синтезируют антитела (гуморальный иммунный ответ). Клеточный иммунный ответ осуществляется Т-лимфоцитами. Т-лимфоциты созревают в тимусе. Там они взаимодействуют с молекулами главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC), экспонированными на поверхности клеток.

Врезультате этого взаимодействия образуются специфические поверхностные структуры с различными функциями. В создании клеточного иммунного ответа важная роль принадлежит цитокинам – они секретируются Т-лимфоцитами. Например, клетки-помощни-

134 ки (Т-хелперы) выделяют интерлейкины, которые ак-

тивируют деление и созревание В-клеток. Т-хелперы несут на своей поверхности гликопротеин CD4. Цитотоксические Т-лимфоциты (клетки-киллеры) обладают способностью лизировать зараженные вирусом клетки и выделять цитокины: γ-интерферон и лимфотоксин α. На поверхности клеток-киллеров находится гликопротеин CD8.

ИММУННЫЙ ОТВЕТ И ЦИТОКИНЫ. В организме существуют различные специфическе механизмы иммунного ответа на инфекции, вызываемые вирусами, бактериями или паразитами. Антитела обладают способностью специфически связываться с внеклеточными патогенами или их токсинами, и такие комплексы служат сигналом для макрофагов, которые уничтожают патоген. Внутриклеточные патогены, например микобактерии или вирусы, а также трансформированные клетки, экспрессирующие гетерологичный белковый продукт, разрушаются по другому механизму: в результате встречи таких патогенов с макрофагом на его поверхности оказываются экспонированными фрагменты лизированных клеток. Это запускает целый каскад реакций, приводящих к разрушению инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. При диабете II типа (аутоиммунное заболевание) собственные белки β-клеток поджелудочной железы воспринимаются иммунной системой как чужие и разрушаются под действием клеток-кил- леров. Взаимодействие большого количества клеток, участвующих в формировании иммунного ответа, осуществяется посредством цитокинов. Клетки иммунной системы несут на своей поверхности рецепторы для цитокинов. Формирование иммунного ответа в организме регулируется по сложному механизму. Факторы роста, специфические для различных типов клеток, обеспечивают образование новых клеток иммунной системы. В настоящее время активно изучаются возможности использования рекомбинантных цитокинов и факторов роста в медицинских целях, и в некоторых случаях уже разработаны стратегии их терапевтического применения.