Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

Клонирование гена соматотропина человека

a Получение фрагментов кДНК соматропина

0

24

191

HaeIII*

Расщепление рестриктазой HaeIII

0

24

24

191

Удаление

Фрагмент не расщеплен

фрагмента

б Экспрессия

0

24

191

Синтетическая

кДНК

препоследова-

тельность

Трансформация

Промотор

клеток E. coli

Синтез

соматотропина

Селективный маркер

* HaeIII – рестриктаза, выделенная из Haemophilus aegyptius

Cтартовая культура

Биореактор

Выделение

Клетки E. coli K12,

Питательная

Лизис клеток, хроматография,

трансформированные

среда для

индуцированное изменение заряда

плазмидой, несущей ген

E. coli, 37 °С

молекулы, гель-хроматография

гормона роста человека

и ионообменная хроматография

Прибыль

при 25 л

при 35 л

молока/сут

молока/сут

Нефикси-

В расходы

рованные

на корм скоту

расходы

включены инъекции

соматотропина

1 раз в неделю

0

10

20

30 см 40

ВВЕДЕНИЕ. Кровь состоит из плазмы и клеток (эрит-

становятся мишенью для действия клеточных проте-

роцитов, лейкоцитов и тромбоцитов). Для организма

иназ. Сейчас ведутся исследования с целью исправ-

кровь – самая главная жидкая среда, обеспечиваю-

ления этих существенных недостатков, например, пу-

щая транспорт веществ, регуляцию температуры,

тем микрокапсулирования гемоглобина для его

водно-солевой обмен и кислотно-щелочное равнове-

направленной доставки.

сие, а также защиту от патогенных факторов. Более

СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН. Этот негликозилиро-

20% всех генов человека кодируют белки крови.

ванный белок (МR 69) синтезируется в печени в ви-

Гемоглобин эритроцитов служит для доставки кисло-

де преальбумина. Сывороточный альбумин составля-

рода к 1013 клеткам организма. Для транспорта в ор-

ет значительную часть белков плазмы крови (около

ганизме нерастворимые в воде вещества часто свя-

60%), поэтому он играет решающую роль в поддер-

зываются с сывороточным альбумином. В настоящее

жании осмотического давления крови. Способность к

время разработаны генно-инженерные методы полу-

комплексообразованию позволяет этому белку

чения многих белков крови, например ингибитора α-

выполнять транспортную функцию путем связывания

антитрипсина, который переносится кровью и служит

с такими труднорастворимыми веществами, как, на-

для защиты легочной ткани от действия эластазы, и

пример, липиды. Препараты, содержащие сыворо-

антибактериального агента лактоферрина, содержа-

точный альбумин, используют прежде всего при

щегося в молоке. Синтез антител и размножение

шоковых состояниях, вызванных большой кровопоте-

клеток, участвующих в иммунном ответе, регулиру-

рей, а также при различных заболеваниях почек и пе-

ются посредством цитокинов. Гормоны осуществля-

чени. Источником сывороточного альбумина служит

ют регуляцию многих клеточных функций с высокой

кровь доноров, из которой белок выделяют в резуль-

специфичностью, например под действием факторов

тате многоступенчатой хроматографической очистки

роста происходит стимуляция роста тех или иных ти-

и высаливания. Прогреванием препаратов при 60 °С

пов клеток. Вязкость крови регулируется сложным

в течение нескольких часов удается обезвредить

каскадом белковых взаимодействий. В норме эта си-

большинство вирусов и других патогенных факторов,

стема предотвращает агрегацию тромбоцитов, а в

которые могут присутствовать в крови донора, однако

случае повреждения кровеносного сосуда способст-

известны случаи, когда при переливании крови про-

вует их связыванию с фибрином. Дефекты такого

исходило заражение пациента. Этим объясняются

комплекса приводят к различным заболеваниям.

многочисленные попытки получить сывороточный

Развитие методов генетической инженерии впервые

альбумин как рекомбинантный белок в процессе фер-

позволило детально изучить процесс поддержания

ментации. Так были получены рекомбинантные штам-

необходимой вязкости крови и разработать препара-

мы Bacillus subtilis, E. coli, пекарских дрожжей и Pichia

ты для терапии нарушений в этой системе.

pastoris, продуцирующие сывороточный альбумин, и

ГЕМОГЛОБИН – белок эритроцитов, обеспечивающий

выведены трансгенные растения и животные (козы), в

перенос кислорода в организме. Гемоглобин взрос-

которых синтезируется этот белок. Однако такие пре-

лого человека негликозилирован и построен из двух

параты пока находятся на стадии испытаний и не до-

идентичных α- и двух идентичных β-цепей, вместе

пущены к медицинскому применению.

составляющих тетрамер α2β2 с молекулярной мас-

ЛАКТОФЕРРИН (МR 69) обладает антибактериаль-

сой 64 кДа. Каждая из цепей несет гемовую группу.

ными и противовоспалительными свойствами, веро-

Связывание молекулы кислорода с одной гемовой

ятно, благодаря своей способности связывать ионы

группой повышает сродство остальных гемовых групп

Fe3+. В материнском молоке содержится до 100 мг/л

к кислороду (аллостерическая регуляция). При силь-

лактоферрина. Для получения рекомбинантного лак-

ных кровопотерях пациент получает жизненно необ-

тоферрина его ген встраивали под промотор αs1-ка-

ходимое количество гемоглобина в форме концент-

зеина в молочных железах коровы, выход белка в

ратов эритроцитов или путем переливания крови.

молоке таких трансгенных коров составлял до 30 г/л.

Однако при этом велика вероятность заражения

Предложено применение этого препарата как обще-

вирусными заболеваниями и возникновения имму-

укрепляющего средства, его следует принимать пе-

нных реакций. Поэтому особенно важным оказалось

рорально.

клонирование гена гемоглобина человека в клетках

Escherichia coli, дрожжей и в трансгенных свиньях.

Перед использованием в медицинских целях экс-

прессированный гемоглобин тщательно очищают ме-

тодами хроматографии. Выделенный белок токсичен

для клеток печени, а также нестабилен вне эритроци-

тов: он легко превращается в αβ-димеры, которые