Материал: Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии (МГУПП)

Рис.10. Вегетативное и бесполое размножение грибов: Вегетативное размножение – А, Б;

Бесполое размножение: А – с помощью конидий, В – с помощью спорангиоспор

Бесполым называется размножение с образованием специализированных органов, появлению которых не предшествует предварительное слияние клеток и их ядер. Чаще всего бесполое размножение у грибов осуществляется посредством спор, образующихся на специализированных органах. Споры грибов образуются в результате митотического деления ядра (такого способа деления, при котором образуются новые клетки идентичные материнским). Споры очень разнообразны по форме: круглые, овальные, цилиндрические, игловидные, звездчатые и т.д. Цвет и размер спор у грибов отличаются разнообразием. Споры могут быть одноклеточными и многоклеточными.

У низших грибов бесполые споры (спорангиоспоры) образуются внутри специализированных вместилищ – спорангиев (рис.10 В). У высших грибов споры (конидии) образуются на специализированных органах, формирующихся на специализированных гифах (рис.10 Г).

Половое размножение у грибов осуществляется путем последовательного слияния специализированных клеток, затем их ядер. В результате образуется особая половая клетка – зигота. Затем следует редукционное деление ядра – мейоз, в результате которого образовавшиеся новые клетки – споры - несут генетическую информацию материнской и отцовской клеток. Споры полового размножения выполняют двойную функцию: сохранение вида и размножения. Споры полового размножения у мицелиальных грибов пищевых производств образуются только при неблагоприятных условиях. На сырье, полупродуктах и готовой продукции пищевых производств мицелиальные грибы размножаются с помощью спор бесполового размножения.

Культуральные признаки. На плотных средах в чашках Петри просматривают характер роста грибов и отмечают размер колоний , их форму, плотность, строение наружного края и центра, характер поверхности, цвет колоний, мицелия и органов размножения, окраску субстрата и обратной стороны колоний, выделение капель жидкости. На плотных средах мицелиальные грибы образуют округлые или широко распространенные по поверхности, не врастающие в субстрат, пушистые, нитевидные, паутинообразные, ватоподобные или мучнистоподобные колонии. Вегетативный мицелий большинства видов не окрашен. Пигментирован только плодоносящий мицелий. Поэтому молодые колонии – белые или сероватые. По мере развития органов плодоношения колонии приобретают окраску – желтую, розовую, бежевую, красную, зеленую, черную и т.п.

Согласно современной классификации распределены на шесть классов грибов: хитридиомицеты, оомицеты, зигомицеты, аскомицеты, базидиомицеты и дейтеромицеты.

Наиболее широко распространены в природе мицелиальные грибы, относящиеся к трем классам: зигомицеты, аскомицеты (сумчатые) и дейтеромицеты (несовершенные).

Зигомицеты имеют неклеточный многоядерный хорошо развитый мицелий, образующий характерный войлокообразный налет на питательной среде. Размножаются зигомицеты как половым, так и бесполым путем с помощью спорангиоспор, формирующихся внутри спорангия.

Их зигомицетов в природе особенно распространены так называемые мукоровые грибы. Наиболее часто среди них встречаются виды родов Mucor и Rhizopus (рис.11).

Рис.11. Грибы родов Mucor (рис.11а) и Rhizopus (рис.11б)

Многие грибы рода Mucor вызывают порчу пищевых продуктов, образуя пушистые налеты. Отдельные виды используют для получения микробного молокосвертывающего фермента – ренина, используемого в сыроделии. Гриб Mucor racemosus способен вызывать слабое спиртовое брожение, в связи с чем его используют, наряду с дрожжами, в некоторых странах Востока при производстве алкогольных напитков и при изготовлении специфических продуктов питания, сброженных из бобов сои.

Грибы рода Rhizopus вызывают так называемую «мягкую гниль» ягод, плодов и овощей. Мукоровые грибы органические кислоты и ферменты.

Среди мукоровых грибов существуют возбудители заболеваний человека и животных. Некоторые из этих грибов являются паразитами насекомых, их используют для уничтожения вредителей сельскохозяйственных культур.

К аскомицетовым грибам относятся мицелиальные грибы с разветвленным клеточным мицелием и дрожжи. Половое размножение осуществляется аскоспорами, образующимися в асках (сумках). Сумки у мицелиальных аскомицетов находятся в плодовых телах, представляющих плотное переплетение гиф. Бесполое размножение мицелиальных грибов осуществляется конидиями, образующимися на конидиеносцах двух форм (рис.12).

а б

Рис.12. Аспергилловые (а) и пеницилловые (б) грибы:

1 – опорная клетка; 2 – конидиеносцы; 3 – фиалиды; 4 – конидии.

Из мицелиальных аскомицетов чаще всего встречаются виды родов Aspergillus и Penicillium (аспергилловые и пеницилловые грибы). У представителей рода Aspergillus (так называемая «леечная плесень») на конидиеносцах образуются вздутия в форме головки (рис.12 а). На ней вырастают фиалиды, на которых развиваются цепочки конидий. Конидиеносцы пенициллов двукратно кистевидно ветвятся. На фиалидах отшнуровываются конидии, образуя цепочки (12 б). Мицелий у видов Aspergillus и Penicillium не окрашен, а конидии имеют различную окраску: чаще всего у Penicillium серовато-зеленую или сине-зеленую, а у Aspergillus- коричневую, черную, желтую, зеленую.

Сумчатые грибы широко распространены в природе. Многие из них являются возбудителями порчи плодов и овощей, многих пищевых продуктов. Некоторые из них вызывают повреждение промышленных изделий и материалов (текстиля, резины, целлофана, пластмасс и др.). Отдельные представители аспергилловых и пеницилловых грибов используют в пищевой и микробиологической промышленности. Некоторые аспергиллы патогенны для человека и животных, вызывают у них поражение дыхательных путей, кожи, слизистой оболочки рта. Примерно 75% мицелиальных грибов, в том числе и аскомицетовых, развиваясь на сырье и готовых пищевых продуктах, выделяют токсичные для человека и животных продукты метаболизма, большая часть из которых являются канцерогенными. Существуют и фитопатогенные аскомицеты – возбудители спорыньи злаковых, склеротинии овощей, монилиоза фруктов. К аскомицетам относятся также трюфели, и сморчки, плодовые тела которых употребляют в пищу, а также строчки, считающиеся условно съедобными, так как некоторые их виды ядовиты.

Несовершенные грибы (дейтеромицеты) – большая группа грибов, включающая как одноклеточные (дрожжи), так и многоклеточные мицелиальные формы. Общим для всех грибов этого класса является отсутствие половой стадии при размножении. Конидии мицелиальных дейтеромицетов образуются на изолированных или расположенных группами конидиеносцах в специальных структурах, называемых пикнидами.

Среди дейтеромицетов довольно широко распространены представители родов Fusarium, Botrytis, Alternaria, Helminthosporium и Geotrichum.

У видов Fusarium (рис.13) гифы разнообразно разветвленные, с перегородками. На питательном субстрате образует белые или окрашенные в розовый, желтый, красно-фиолетовый или коричневый цвет колонии, поверхностные или погруженные в среду. Пигмент нередко диффундирует в сусбтрат, окрашивая его в разные оттенки – от розового до коричневого. Образует два типа конидий. Макроконидии имеют характерную веретено-серповидную форму, с одной или несколькими поперечными перегородками. Микроконидии – мелкие, овальные, бесцветные, одноклеточные, реже с одной или с двумя перегородками. Конидиеносцы нитевидные, простые или разветвленные, рассеянные по всему мицелию. Известно более 800 видов фузариев. Они щироко распространены в природе. Среди них много паразитических форм, вызывающих заболевания злаков, корне- и клубнеплодов. Некоторые виды образуют канцерогенные вещества. F. moniliforme используют для производства гиббереллина – стимулятора роста растений.

Рис.13. Fusarium: а-конидии; Рис.14. Botrytis

б - мицелий

Грибы рода Botrytis развиваются в виде стелющегося серо-оливкового многоклеточного мицелия, пронизывающего субстрат. Конидиеносцы септированные, бесцветные, дымчатые или бурые, древовидно разветвленные, реже – простые, на концах слегка вздутые. На конидиеносцах образуются короткие, густо сидящие зубчиковидные фиалиды с гроздями или головками конидий. Конидии яйцевидные, эллиптические, иногда шаровидные или удлиненные, бесцветные, серые или оливковые. Botrytis cinerea ( от греч.botrytis – гроздь, cinerea – серая, как зола) вызывает гниль сахарной свеклы, винограда, плодов, ягод и других культурных растений, продуцируют целлюлозолитические, пектолитические и другие ферменты.

Род Alternaria (рис.15) характеризуется своеобразным многоклеточными с поперечными и продольными перегородками, темноокрашенными груше-

Видными или заостренно-вытянутыми конидиями, одиночными или соединенными в цепочки, сидящими на слабо развитых конидиеносцах. Колонии вначале светлые, пушистые, затем зеленовато-серые или оливково-черные, бархатистые, ворсистые. Выделяемый пигмент диффундирует в среду, окрашивая ее в черный цвет. Разные виды Alternaria широко распространены в почве, вызывают у сельскохозяйственных растений альтернариоз (черную гниль).

Рис.15 Alternaria Рис.16 Helminthosporium Рис.17 Geotrichum

Род Helminthosporium (рис.16) образует темноокрашенные конидии, прямые или слегка изогнутые, цилиндрические, веретенообразные или булавовидные с несколькими поперечными перегородками. Болезни злаков, вызываемые грибами этого рода, называют гельминтоспориозами. По форме и проявлению они весьма разнообразны. Гельминтоспориоз может проявляться в виде корневой гнили, различного типа пятнистости листьев, черных узлов на стеблях, сажистых налетов на колосьях (черный зародыш семян). Некоторые виды этого рода грибов относятся к сапрофитам и развиваются на корнях, листьях, сухих ветвях, стеблях древесных и травянистых растений.

Род Geotrichum (рис..17) образует сильно разветвленный, клеточный, белый, мучнистоподобный мицелий. Гифы легко распадаются на прямоугольные или овальные оидии, служащие для размножения и напоминающие дрожжи. Geotrichum candidum развивается в виде бархатистого белого налета (пятен) на поверхности хранящихся кисломолочных продуктов, сливочного масла, сыров, квашеных овощей, прессованных дрожжей, на плохо высушенном хмеле, на стенках оборудования, сырых помещений.

План проведения занятия

1. Ознакомиться с морфологией грибов (см. на стр.20…26 и главу 1 учебника.

2. Ознакомиться с приготовление препарата грибов типа «раздавленная капля».

3. Описать культуральные признаки изучаемых грибов.

4. Приготовить препараты грибов Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Helminthosporium, Geotrichum. Промикро-скопировать с объективами 10х и 40х и зарисовать. На рисунках дать обозначение органов размножения и деталей их строения.

5. Просмотреть грибы на чашках Петри под бинокулярным микроскопом с увеличением 4х и 10х.

Методические указания

1. Большинство мицелиальных грибов, развиваясь на пищевых продуктах, размножаются бесполым путем (спорами, конидиями, оидиями). Поэтому на лабораторных занятиях рассматриваются только способы бесполого размножения на примерах грибов – распространенных возбудителей порчи продуктов. Культуры этих

грибов выращивают в чашках Петри¹ на среде сусло-агар. Культуры в чашках не следует без надобности держать открытыми, так как споры грибов легко осыпаются и рассеиваются, что может привести к нежелательной контаминации ими лаборатории и самих чистых культур.

Вначале просматривают и описывают культуральные признаки грибов визуально. После визуального просмотра приступают в микроскопическому изучению морфологических признаков - мицелия и органов размножения с увеличениями 40х, 100 и 400х. При небольшом увеличении 40х и 100х выясняют наличие воздушного мицелия, его характер, расположение спорангие- и конидиеносцев, спор и конидий. Наблюдения ведут у края колонии, на границе пигментированной и неокрашенной части колонии и в центре.

Приготовление препаратов грибов для микроскопирования производят двумя обожженными и затем охлажденными препаровальными иглами. На обезжиренное чистое предметное стекло наносят каплю смеси равных объемов глицерина и этилового спирта (1:1). Отбирают небольшой кусочек мицелия вместе с плодоносящими гифами и прилегающей к нему тонким слоем питательной среды. В эту каплю вносят отобранный кусочек мицелия гриба. Осторожно, не нарушая структуры мицелия, расправляют гифы мицелия и плодоносящие органы иглами, после чего накрывают покровным стеклом и слегка прижимают.

2. Для приготовления препарата гриба Rhizopus нужно двумя предварительно обожженными и охлажденными препаровальными иглами (рис.2) взять его черновато-серый пушистый воздушный мицелий и накрывать покровным стеклом осторожно, без резкого броска, чтобы не раздавить спорангии – вместилища спорангиоспор. После этого иглы обжечь в пламени горелки.

При микроскопировании выявить одноклеточное строение мицелия

----------------------------------------------------------------------------------------------------

¹ Чашки Петри – стеклянные, круглые, плоские чашки с крышкой диаметром 6…11 см и

высотой 1,5…2 см.

и органы размножения – спорангиеносцы. Рассмотреть их по всей длине, передвигая соответствующим образом препарат. Спорангиеносцы Rhizopus крупные, неветвящиеся, отрастают как

правило от грибницы пучками. Спорангии, сидящие на их верхушках (спорангиеносцах), крупные, шарообразные, с массой спор, которые видны через тонкую прозрачную оболочку спорангиев. Спорангиоспоры одноклеточные, округлые или эллипсоидальные, бесцветные или сероватые (рис.11б).

В препарате всегда есть много свободно лежащих спор, высыпавшихся из некоторых лопнувших спорангиев.

3. Для приготовления препарата гриба Aspergillus взять воздушный окрашенный мицелий. При микроскопировании найти многоклеточные гифы мицелия и органы размножения – конидиеносцы. Конидиеносец по внешнему виду простой, одноклеточный, ветвящийся. На его конце имеется булавовидное вздутие, на котором расположены в один ярус бутылочковидные фиалиды, а на них в виде цепочек – конидии. Верхушка канидиеносца с массой неосыпавшихся спор кажется плотной, плохо просвечивается, ее можно рассмотреть лишь при осыпании спор (рис. 12а).

4. Для приготовлении препарата гриба Penicillium рекомендуется брать более молодую, зеленую часть грибницы – на границе с белым краем ее, заметно внедряясь в нее препаровальными иглами.

При микроскопировании найти многоклеточные гифы и органы размножения – конидиеносцы. Они представляют собой многоклеточные гифы, кистевидно разветвленные на концах. На концах ветвей расположены фиалиды (по 2…4), а на фиалидах – цепочки одноклеточных конидий, имеющих голубовато-зеленую окраску с различными оттенками (рис.12б).