Подготовка питательных сред, посуды, материалов и инструментов к стерилизации.

Питательные среды и жидкости, предназначенные для стерилизации, разливают в колбы и пробирки не более, чем на половину их высоты. Сосуды закрывают ватными пробками, обтянутыми марлей. Пробки должны быть достаточно плотными, с равномерным распределением волокна ваты. Ватные пробки предохраняют среду от инфицирования микроорганизмами и обеспечивают проникновение пара в сосуд при автоклавировании. Сверху на пробку надевают бумажный колпачок, который фиксируется на горлышке сосуда с помощью шпагата или аптечной резинки. Колпачок предохраняет пробку от выбивания при возможном резком падении давления в автоклаве.

Посуду перед стерилизацией тщательно моют, сушат и заворачивают в бумагу для сохранения стерильности после прогревания.

Каждую пипетку заворачивают отдельно в длинные полоски бумаги, шириной 4-5 см. В верхний конец пипетки, который микробиолог при выполнении работ берет в руку, предварительно вставляют ватные тампоны. (тампоны выполняют ту же роль, что и ватные пробки). Заворачивание пипетки начинают с капиллярного, узкого конца по спирали. Постепенным движением бумаги по спирали заканчивают обмотку у конца с ватным тампоном. Бумага должна плотно охватывать пипетку. Завернутые пипетки заворачивают по несколько штук вместе в бумагу для предотвращения индивидуальной упаковки от загрязнений и разрывов или помещают в специальные металлические или картонные пеналы.

Шпатели обертывают по отдельности, а потом, как и пипетки, объединяют.

Чашки Петри заворачивают вместе по 2-4-8 штук, либо помещают в специальные, плотно закрывающиеся металлические пеналы.

Колбы, пробирки и другие сосуды закрывают ватными пробками, на которых сверху фиксируют бумажный колпачок.

Различные приспособления и материалы, используемые в работе с микроорганизмами, также стерилизуют, плотно упакованными в бумагу. Там, где это необходимо, предварительно вставляют ватный тампон.

Наиболее часто используемые способы стерилизации питательных сред, посуды и других материалов представлены в таблице 1.

Способы стерилизации лабораторных материалов. Таблица1.

Контрольные вопросы к теме 3.

1. Дайте определение понятия «культивирование».

2. Перечислите составные части процесса культивирования.

3. Чем определяется состав питательной среды для культивирования?

4. Какие Вы знаете питательные среды? По составу? По физическому состоянию? По назначению?

5. Что понимается под чистой культурой?

6. Методы и этапы выделения чистой культуры.

7. Понятие «посевной культуры».

8. Методы культивирования микроорганизмов.

9. Какова закономерность роста микроорганизмов при периодическом культивировании?

10. Какие среды (по физическому состоянию) применяют при поверхностном культивировании? При глубинном?

11. Перспективы применения поверхностного и глубинного способов.

12. Непрерывное культивирование и его основное условие.

13. Какие Вы знаете физические методы стерилизации?

14. Что такое тиндализация и в каких случаях она применяется?

15. Назовите, на Ваш взгляд, наиболее надежный способ стерилизации.

Тема 4. Микроорганизмы природных биотопов.

Роль микроорганизмов в биосфере.

Жизнь на планете Земля сосредоточена в биосфере - т.е. той части планеты, которая включает всю совокупность живых существ и в которой возможна постоянная жизнь. Биосфера делится на три среды:

• литосферу – твердую верхнюю оболочку земной коры (т.е. поверхность материков);

• гидросферу – водную оболочку земли;

• тропосферу – нижние слои воздушной оболочки.

В строго определенных условиях окружающей среды формируются биоценозы – группировки совместно обитающих и взаимосвязанных организмов, занимающих определенную территорию, приспособленных к среде обитания и друг к другу.

Место обитания биоценоза называется биотопом. Примером биотопов могут служить воздух, вода, растения, организм человека и т.п.

Совокупность биотопа и биоценоза составляют экосистему. Экосистема состоит из элементов живой и неживой природы.

Основную массу живых существ биосферы составляют микроорганизмы.

Микроорганизмы широко распространены в природе: они находятся в почве, воздухе, пресных и соленых водоемах, на растениях, в организме человека и животных и т.д. Однако состав микроорганизмов в зависимости от их условий обитания различен. Численность и качественное разнообразие микроорганизмов в биоценозах зависит от условий внешней среды, т.е. от наличия питательных веществ, температуры, важности, содержания кислорода, освещенности и т.п.

В результате деятельности организмов биоценозов в биосфере происходит круговорот веществ. Роль микроорганизмов в круговороте веществ необыкновенно велика благодаря их высокой численности и повсеместному распространению. В круговороте веществ микроорганизмы выступают в роли продуцентов органических веществ и их деструкторов. Микробные биоценозы разрушают органическое вещество отмерших животных, растений, а так же клетки микроорганизмов, превращая его в простые минеральные. Эти минеральные соединения растворяются в воде и могут быть усвоены растениями, фотоавтотрофными и хемоавтотрофными микроорганизмами для построения органических веществ.

.

Микроорганизмы литосферы

Почва является естественной средой обитания для огромного числа микроорганизмов и основным природным резервуаром, откуда они попадают во внешнюю среду – воздух и воду. В 1г почвы число микроорганизмов может изменяться от сотен до миллиардов клеток.

Микроорганизмы в почве распределены неравномерно. Их численность и видовой состав зависят от содержания в ней органических веществ и влаги, ее структуры и степени окультуривания, климатических условий, характера растительного покрова, степени ее загрязнения отходами хозяйственной деятельности человека и многих других факторов.

В верхних слоях почвы микроорганизмов больше, по мере углубления их количество уменьшается и на глубине в 2–5 м встречаются единичные клетки. Беден микроорганизмами и самый верхний слой толщиной около 5 см., в котором наблюдается недостаток влаги и который подвергается действию ультрафиолетовых лучей солнечного спектра. В верхних слоях почвы преобладают аэробы, в более глубоких – анаэробы.

Наиболее распространены в почве грибы, актиномицеты и бактерии - гнилостные, маслянокислые, кишечной группы, азотфиксирующие, нитрифицирующие, денитрифицирующие, клубеньковые, серо- и железобактерии; в меньшей степени – дрожжи, водоросли, простейшие, вирусы. Среди них встречаются как автотрофы, так и гетеротрофы, принимающие активное участие в почвообразовательных процессах. Они разлагают растительные и животные остатки в почве и превращают их в гумус, а также минерализуют органические вещества. Под влиянием микроорганизмов происходит синтез новых органических веществ в почве, изменяется ее структура, кислотность. Под действием микробов-антагонистов происходят процессы самоочищения почвы.

Среди основной массы сапрофитных микроорганизмов в почве встречаются и паразиты. Они попадают в почву с выделениями человека, с трупов людей и животных, погибших от инфекционных заболеваний.

Попадая в почву, значительная часть патогенных неспорообразующих микроорганизмов погибает в течение нескольких дней или месяцев. Значительно дольше сохраняются в почве спорообразующие патогенные бактерии – аэробы и анаэробы. Их споры могут сохраняться в почве десятки лет. Такие почвы представляют большую опасность в эпидемиологическом отношении, так как могут явиться причиной заражения сырья и пищевых продуктов патогенными микроорганизмами непосредственно или через воду. Поэтому следует систематически проводить оценку санитарно-микробиологического состояния почвы и процессов ее самоочищения.

При санитарной оценке почвы учитывают результаты химического, гельминтологического и микробиологического анализов.

При микробиологическом исследовании почвы в зависимости от поставленной задачи применяют краткий и полный санитарно-микробиологический анализ. Краткий анализ почвы предусматривает определение двух микробиологических показателей: КМАФАнМ, или общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, и коли-титра (наименьший объем, в котором обнаруживается кишечная палочка). Полный анализ включает в себя определение КМАФАнМ, коли-титра, а также титра анаэробов (БГКП и Clostridium perfringens), протеев, термофилов.

Показатель КМАФАнМ санитарно безопасной почвы не превышает 1,5х10⁵ КОЕ/г , в загрязненной почве он в несколько раз больше. Наличие в почве БГКП и Clostridium perfringens свидетельствует о ее фекальном загрязнении. Выявление в почве бактерий Proteus свидетельствует о загрязнении ее органическими веществами животного происхождения или фекалиями людей. Термофильные микроорганизмы являются показателями загрязнения почвы навозом, компостами. В безопасных почвах термофилы не обнаруживаются.

Определение перечисленных показателей чаще проводят традиционными способами: высевом разведений на плотные питательные среды, методом наиболее вероятного числа, мембранным фильтрованием, методом накопительной культуры с последующим выявлением и идентификацией микроорганизмов выделяемого вида по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. В последнее время получают распространение ускоренные методы микробиологических анализов, основанные на применении экспресс-тестов, например, Mikrocount combi, Singlepath и др., или основанные на измерении импеданса с применением микробиологических анализаторов типа «БакТрак».

Микроорганизмы гидросферы.

Природные воды, как и почва, являются естественной и достаточно благоприятной средой обитания многих микроорганизмов, где они способны жить, размножаться, участвовать в процессах круговорота веществ. Количественный и качественный состав микроорганизмов природных вод разнообразен. Численность микроорганизмов в воде определяется главным образом содержанием в ней органических веществ. В 1см³ воды число микробных клеток может превышать несколько миллионов.

Микроорганизмы воды представлены водорослями, простейшими, бактериями, мицелиальными грибами, вирусами и другими группами микроорганизмов.

По своему происхождению природные воды подразделяются на атмосферные, подземные, и поверхностные.

Основная масса микробов попадает в водные источники из почвы. Поэтому в стоячей воде их больше, чем в водоемах с проточной; в прибрежной зоне больше, чем в удалении от берега. Особенно много микроорганизмов в придонных слоях воды и в поверхностном слое ила на дне водоема.

Атмосферные воды встречаются в виде дождя, снега, града, льда.

Дождевая вода бедна микроорганизмами и обогащается ими, захватывая и увлекая из воздуха мельчайшие частицы пыли. В связи с этим дождевая вода над городской местностью значительно богаче микроорганизмами, чем над сельской.

Снег, как и дождевая вода, практически свободен от бактерий и все же в 1 см³ только что выпавшего и растопленного снега даже в самые сильные морозы насчитывается от нескольких десятков до нескольких сотен бактерий.

Численный состав микроорганизмов града и льда различен и зависит от качества воды, из которой они образовались.

Подземные воды. К ним относятся артезианские, ключевых, грунтовые воды. Состав подземных вод зависит главным образом от глубины залегания водоносного слоя и его защищенности от попадания загрязнений извне.

Артезианские воды, находящиеся на больших глубинах, содержат очень мало микроорганизмов.

Ключевые воды весьма бедны микроорганизмами, но смешиваясь с грязными потоками воды во время дождя, они могут содержать до нескольких тысяч микробных клеток в 1 см³.

К грунтовым водам относятся подземные воды неглубокого залегания от нескольких сантиметров до нескольких метров. Чем ближе к поверхности расположены грунтовые воды, тем обильнее количественный и качественный состав микроорганизмов в них.

Поверхностные воды расположены в углублениях суши и бывают естественными и искусственными.

Океаны, моря, реки, озера, болота – естественные водоемы.

В морской воде микроорганизмов несравненно меньше, чем в пресной, но даже микробиота арктических морей представлена достаточно большим числом видов. В водах Мирового океана были обнаружены бактерии родов Micrococcus, Sarcina, Pseudomonas, Bacillus и др., дрожжи родов Candida, Saccharomyces, Torulopsis, Rhodotorula, Pichia и др., актиномицеты и некоторые грибы.

Проточная вода в реках содержит разное количество микроорганизмов в зависимости от времени года, питающих ее источников, территории, по которой течет река. Весной и осенью численность микроорганизмов в речной воде, среди которых могут быть и патогенные, резко возрастает. Речная вода, протекающая через населенные пункты, сильно загрязняется, поэтому ниже по течению от населенных мест в ней содержится гораздо больше микроорганизмов, чем выше по течению.

Озера представляют собой водоемы со стоячей водой. Озера бывают сточными и бессточными в зависимости от того, берут от них начало реки или нет. Численность микроорганизмов в озерной воде определяется условиями происхождения озера, климатической зоной, степенью солености воды в нем и может составлять в среднем от 150 тыс. до 10 млн. в 1 см³.

Болота представляют собой неглубокие, частично или полностью закрытые сверху растительностью скопления воды, в которых образуется торф (переходное состояние между водой и сушей). Болота могут быть низинными, если они питаются грунтовыми водами, и верховыми, питающимися за счет атмосферных осадков. Микроорганизмов в болотных водах немного, что объясняется ее высокой кислотностью, крайне слабой минерализацией. Болотная вода всегда насыщена метаном вследствие разложения органических остатков в анаэробных условиях. Этим обусловлено развитие в болотных водах специфических групп микроорганизмов, так как для большинства микробных клеток выделяющиеся метан и сероводород ядовиты.