Материал: Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии (МГУПП)

фильтровальной бумагой, а затем –

на воздухе до полного его высыхания.

На препарат наносят каплю иммерсион-

ного масла и микроскопируют с объек-

тивом 100х.

Рис.4 Кювета с параллельными

рейками для окрашивания

препарата

При сложных способах окрашивания применяют два или более красящих вещества. Кроме красящих, используют различные обесцвечива-ющие вещества (спирт и др.). Такие способы окрашивания называют диф-ференциальными. Дифференциальныая окраска предполагает окрашивание определенных структур клетки. С ее помощью выявляют некоторые клеточные структуры, запасные вещества и включения.

Окраска по Граму.

5. На обезжиренном предметном стекле делают мазки разных бактерий: в центре мазок исследуемой культуры, слева и справа – контрольных культур (рис.5), одна из которых должна быть грамположительной (Sarcina), другая – грамотрицательной (Escherichia coli). Мазки готовят, как и при простом способе (см. с. ).

6. На мазки наносят 2…3 капли раствора кристаллического фиолетового и через 2…3 мин окрашивания краску смывают водой.

7. Наносят 2…3 капли раствора Люголя и по истечении 1…2 мин смыва-ют водой (препарат чернеет).

8. Препарат обесцвечивают 0,5…1,0 мин 96%-ным этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1…2 мин водным фуксином. Препарат промывают водой, высушивают и

Рис.5. Схема приготовления препарата при окраске по Граму:

1 – мазок грамположительных бактерий; 2 – мазок грам-

отрицательных бактерий; 3 – исследуемая культура.

микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные – розово-красный цвет.

Цель занятия. Изучить правила пользования с иммерсионной системой микроскопа «Биолар-4». Усвоить технику приготовления препарата фиксированных окрашенных клеток простым и сложным способами.

Задание

1. Ознакомиться с правилами работы с иммерсионной системой микроскопа.

2. Промикроскопировать готовый препарат – «мазок» молочнокислых бактерий Streptococcus lactis с объективом 100х и зарисовать.

3. Приготовить, промикроскопировать и зарисовать препараты бактерий Sarcina, Micrococcus, Pseudomonas и Bacillus, окрашенных простым способом, с объективом 100х.

4. Промикроскопировать окрашенный по Граму готовый препарат бактерий, предложенный преподавателем, зарисовать и отметить их отношение к окраске по Граму с объективом 100х.

Оборудование и материалы. Микроскопы, флаконы с кедровым маслом, готовые окрашенные микробные препараты «мазок»), предметные стекла, красители – раствор фуксина, генциан-виолет, раствор Люголя, 96%-ный этиловый спирт, фильтровальная бумага – по числу студентов.

Контрольные вопросы

1. Что такое простые способы окраски препаратов и для чего их используют?

2. Какие способы окраски препаратов называют сложными и для чего их используют?

3. Что такое «Окраска по Граму» и где ее применяют?

4. Что такое иммерсионные объективы?

5. Зачем и как используют иммерсионное масло при работе с иммерсионным объективом?

Тема 2. Морфология микроорганизмов

Лабораторная работа 3.

«Изучение основных морфологических признаков бактерий»

Бактерии составляют наиболее обширную и разнообразную группу микроорганизмов. Большинство бактерий – это одноклеточные организмы с прокариотическим типом строения клетки. Размножение бактерий осуществляется путем поперечного деления клетки на две равные части. Клетки после деления могут разъединяться, однако, у некоторых видов остаются вместе, образуя различные сочетания.

В пищевых производствах встречаются бактерии шаровидной (рис.5) и палочковидной (рис.6) форм.

Шаровидные бактерии (кокки) по расположению клеток подразделяют на микрококки – клетки, расположенные одиночно; диплококки – клетки, соединенные по две; тетракокки – клетки, соединенные по четыре в виде тетраэдра; стрептококки – кокки, расположенные в цепочки различной длины; сарцины – скопления кубической формы, напоминающие пакеты; стафилококки – скопления клеток, напоминающие грозди винограда.

Рис.5. Шаровидные бактерии: а – микрококки; б - диплококки;

в – тетракокки; г – стрептококки; д – стафилококки;

е – сарцины

Диаметр шаровидных форм колеблется от 1,0 до 2,5 мкм. Шаровидные бактерии по Граму красятся положительно.

Палочковидные бактерии имеют цилиндрическую форму. Длина клеток колеблется от 2 до 5 мкм, иногда 10…12 мкм. Ширина колеблется от 0,5 до 1 мкм.

а б в г

Рис.6. Палочковидные бактерии: а – палочки без спор; б – спорообразующие бактерии

рода Bacillus; в , г – спорообразующие бактерии рода Clostridium.

Палочки могут быть соединены попарно или в цепочки. Палочковидные бактерии бывают неспорообразующие (рис.6а) и спорообразующие (рис.6 б, в, г). Среди палочковидных бактерий есть подвижные и неподвижные формы. Неспорообразующие палочковидные бактерии грамотрицательные (за исключением палочковидных молочнокислых бактерий), спорообразующие бактерии по Граму красятся положительно. Эндоспоры бактерий формируются при неблагоприятных для бактерии условиях, являются покоящимися формами и выполняют защитную функцию. Обычно спорообразование происходит при исчерпании питательных веществ в среде, а также при несоответствии температуры, рН, влажности и т.п. оптимальным условиям для развития бактерии. Цитоплазма и ядерное вещество в спорогеной зоне концентрируются и уплотняются. Проспора (уплотненное тельце) покрывается многослойной оболочкой и образуется спора. Эндоспоры отличаются низким содержанием воды. Ферменты споры находятся в неактивном состоянии. Споры в клетке могут располагаться центрально и латерально, не изменяя форму клетки. Такое расположение спор характерно для бактерий рода Bacillus (рис.6 б). Для бактерий рода Clostridium характерно изменение формы клетки (рис.6 в, г) при образовании эндоспоры, в результате клетка приобретает форму веретена или теннисной ракетки.

Когда спора сформируется, клеточная стенка и остальные части клетки разрушаются, а спора высвобождается.

Споры хорошо переносят высушивание , длительное кипячение и другие неблагоприятные воздействия, которые губительны для вегетативных клеток.

В клетке бактерий образуется только одна эндоспора, которая при благоприятных условиях вновь прорастает в одну вегетативную клетку, поэтому спорообразование у бактерий не является способом размножения.

Многие бактерии образуют капсулу снаружи клеточной стенки, представляющую скопление слизистого вещества (полисахариды, полипептиды). В зависимости от размера различают микрокапсулу и макрокапсулу. При микроскопировании капсулированных бактерий капсулы имеют вид бесцветного ореола (рис.7), окружающего клетки, так как вещество капсул слабо фиксирует краситель и легко отмывается в процессе обработки препарата.

Рис.7. Капсулообразующие Рис.8. Актиномицеты: а - мицелий; б – спороносцы.

бактерии

Чаще всего для выявления капсул применяют способ «негативной» окраски (негативного контрастирования) с помощью жидкой туши. Для этого небольшое количество клеток с плотной среды помещают в каплю разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, накрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 40х.

При этом на общем темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки бактерий, окрашенные в розовый цвет (рис.9).

К бактериям относится еще одна, встречающаяся в пищевых производствах особая группа микроорганизмов – актиномицеты (рис.8), которые также не имеют истинного ядра. Их клетки в основном имеют вид тонких длинных пря­мых ветвящихся нитей (рис.8а) и по внешнему виду похожи на клетки мицелиальных грибов. Актиномицеты обитают в воде, почве, попадают на растительные остатки и зерно, придавая им специфический землистый запах. Размножаются актиномицеты с помощью экзоспор, которые формируются на концах воздушного мицелия – спороносцах, последние имеют самую разнообразную форму (рис.8б). Актиномицеты являются грамположительными бактериями.

Цель занятия. 1.Закрепить технику приготовления и микроскопирования препарата- мазка.

2. Ознакомиться с некоторыми морфологическими особенностями бактерий, используя простые и сложные способы окрашивания и различные красители.

Задание

1. Приготовить препарат фиксированных окрашенных фуксином клеток шаровидных, палочковидных неспорообразующих и спорообразующих бактерий. Технику приготовления препарата, окрашенного простым способом, смотреть на стр. 13.

2. Промикроскопировать приготовленные препараты с объективом 100х и зарисовать, отметив взаимное расположение кокков, палочковидных бактерий, наличие и расположение спор у спорообразующих бактерий. Споры в окрашенных клетках не прокрашиваются, так как оболочка их мало проницаема для краски, и выглядят они в виде светлого пятка в клетке.

3. Приготовить препарат бактерии, предложенной преподавателем, и исследовать её отношение к окраске по Граму.

4. Промикроскопировать и зарисовать с объективом 100х, отметив её отношение к окраске по Граму.

5. Приготовить и промикроскопировать с объективом 40х и зарисовать препарат капсулообразующих бактерий (по усмотрению преподавателя) (способ окраски см. стр.18).

Оборудование и материалы. Микроскопы, флаконы с кедровым маслом, предметные стекла, красители – раствор фуксина, генциан-виолет, раствор Люголя, 96%-ный этиловый спирт, раствор туши, фильтровальная бумага – по числу студентов.

Контрольные вопросы

1. Какие формы клеток бактерий встречаются в пищевых производствах?

2. Какие группы шаровидных бактерий Вы знаете? Как они называются?

3. Какие бактерии образуют споры?

4. Как располагаются споры в клетках спорообразующих бактерий?

5. Какое значение имеют бактериальные эндоспоры? Какими свойствами они обладают?

6. Что такое капсулы, когда образуются?

7. Что такое актиномицеты? Где они встречаются ?

Лабораторная работа 4.

Тема 2. Морфология микроорганизмов. Продолжение.

«Изучение основных морфологических и культуральных признаков мицелиальных грибов».

Грибы – это обширная группа эукариотных микроорганизмов, составляющих царство Mycota. Все грибы делят на две группы: макромицеты и микромицеты (мицелиальные грибы и дрожжи). У первых образуются крупные плодовые тела (например, у шляпочных грибов), у вторых они отсутствуют, и весь жизненный цикл у них предоставлен микроскопическими формами.

Морфологические признаки. Вегетативное тело простейших примитивных грибов состоит из одной клетки без клеточной стенки. Преобладающее большинство мицелиальных грибов имеет мицелиальное строение. Одноклеточные грибы, утратившие способность к мицелиальному росту, называются дрожжами и относятся к различным систематическим группам.

Их вегетативное тело представлено мицелием (грибницей), который состоит из системы ветвящихся нитей, называемых гифами. Толщина гиф мицелия варьирует от 2 до 30 мкм и более. Нити часто хорошо видны невооруженным глазом. Мицелий пронизывает субстрат и вcей поверхностью поглощает из него питательные вещества (субстратный мицелий), а также располагается на его поверхности и может подниматься над субстратом (поверхностный и воздушный мицелий). На воздушном мицелии обычно образуются органы размножения. Мицелий низших грибов лишен перегородок (септы) – неклеточный мицелий. У высших грибов мицелий разделен перегородками (клеточный), однако септы у грибов имеют центральные поры, через которые осуществляется транспорт веществ.

Грибы, в отличие от бактерий, характеризуются разнообразием способов размножения – вегетивным, бесполым и половым. Органы бесполого и полового размножения грибов чрезвычайно разнообразны по строению и являются основой классификации этих организмов.

Одни грибы вегетативно размножаются без образования специализированных органов. Чаще всего это размножение отдельными участками (фрагментами) мицелия. Каждый участок мицелия, попадая на питательную среду, способен дать начало новому организму, подобному исходному. У других грибов гифы распадаются на отдельные клетки овальной или цилиндрической формы (оидии)(рис.10 А). У некоторых грибов такие клетки до своего разделения покрываются толстой оболочкой – хламидоспорам (рис.10 Б).