Материал: Определение характеристик макета БПК-биосенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС с использованием различных синтетических сточных вод

Рис. 19 - Линейный участок зависимости ответа сенсора от концентрации субстрата

Обсчет уравнения прямой был сделан с помощью двух программ и вручную (приложение 2). Параметры уравнения прямой, аппроксимирующей линейный участок зависимости ответа сенсора от концентрации субстрата для биосенсора на основе клеток Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС, представлены в таблице 4

Таблица 5 - Параметры уравнения прямой, аппроксимирующей линейный участок калибровочной зависимости: R = a×C + b

Верхняя граница линейной зависимости была определена из уравнения Михаэлеса-Ментен. И составляет 44±2 мг/дм3 на основе ГГС-стандарта.

Зависимость ответа сенсора от концентрации для ОЕСD- синтетических сточных вод

О содержании анализируемых веществ в образце необходимо знать калибровочные характеристики биосенсора, то есть зависимость аналитического сигнала от БПК.

По полученным экспериментальным данным была построена градуировочная зависимость отклика биосенсора от БПК в измерительной кювете.

Рис. 20 - Зависимость ответа сенсора от БПК

Была произведена аппроксимация зависимости ответа сенсора от БПК субстрата с помощью уравнения Михаэлиса - Ментен. Параметры были рассчитаны с помощью программы Sigma Plot (см. приложение 2). Параметры уравнения для биосенсоров на основе используемых штаммов приведены в таблице 6.

Таблица 6 - Параметры уравнения Михаэлиса - Ментен калибровачной зависимости

Полученные зависимости величины ответа сенсора от БПК имеют гиперболический вид.

Далее были проведены дополнительные опыты по определению зависимости ответа сенсора от БПК на линейном участке градуировочной прямой. По полученным данным построен график зависимости ответа сенсора от БПК. (рис. 21)

Рис. 21 - Линейный участок зависимости ответа сенсора от БПК

Обсчет уравнения прямой был сделан с помощью двух программ и вручную (смотри приложение 2). Параметры уравнения прямой, аппроксимирующей линейный участок зависимости ответа сенсора от БПК для биосенсора на основе клеток Debaryamyces hansenii иммобилизованных в модифицированный поливиниловый спирт представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Параметры уравнения прямой, аппроксимирующей линейный участок калибровочной зависимости для OECD-синткетических сточных вод: R = a×C + b

Высокие значения коэффициента корреляции рецепторного элемента характеризует то, что выбранный участок с большой достоверностью может быть аппроксимирован линейной зависимостью.

С использованием ОЕСD - синтетических сточных вод верхняя граница определяемых БПК составляет 1,21±0,08 мг/дм3.

Коэффициент чувствительности биосенсора

Простейшей численной характеристикой чувствительности служит коэффициент чувствительности. Он определяется как производная аналитического сигнала по концентрации определяемого компонента:

Если градуировочная функция линейна (R=а×C+b), то коэффициент чувствительности - это тангенс угла наклона градуировочной прямой a. Чем выше коэффициент чувствительности, тем меньшие количества компонента можно обнаруживать и определять, получая один и тот же аналитический сигнал, тем точнее можно определить одно и то же количество вещества.

В настоящей работе чувствительность сенсоров находили как тангенс угла наклона калибровочной прямой в координатах ответ сенсора - концентрация субстрата. При использовании ГГС-стандарта чувствительность составила 0,031±0,008 мин-1. При применение ОЕСD - синтетических сточных вод для калибровки БПК-датчика чувстительность составила 0,56±0,02 мин-1. Таким образом чувствительность сенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii к OECD-синтетическим сточным на порядок превышает чувствительность к ГГС.

В случае амперометрических биосенсоров повысить чувствительность датчика оказывается, возможно путем увеличения количества иммобилизованного фермента либо за счет увеличения истинной поверхности индикаторного электрода на микро уровне (увеличение фактора шероховатости) [63].

Однако использование величины а для описания чувствительности имеет ряд недостатков. Во-первых, коэффициент чувствительности -величина размерная, поэтому сопоставление коэффициентов чувствительности для принципиально разных (различающихся природой аналитического сигнала) методов невозможно. Во-вторых, сопоставление величин а даже одинаковой размерности имеет смысл действительно только "при прочих равных условиях", т.е. в первую очередь при одинаковой точности измерения аналитических сигналов. Поэтому для характеристики чувствительности используют еще две величины, называемые пределом обнаружения и нижней границей определяемых содержаний.

Предел обнаружения

Предел обнаружения (Cmin) - это наименьшее содержание вещества которое может быть обнаружено данной методикой с заданной степенью достоверности. Таким образом, предел обнаружения характеризует методику с точки зрения возможностей качественного анализа.

Предел обнаружения соответствует наименьшей концентрации, которая дает сигнал, отличимый от значения холостого опыта. При доверительной вероятности Р = 0,95 данный параметр можно определить по формуле:

, где

- стандартное отклонение холостого опыта, а - коэффициент чувствительности

Из этой формулы следует, что предел обнаружения зависит не только от коэффициента чувствительности а, но и от S0, т.е. точности измерения аналитических сигналов. Чем она выше, тем меньше Сmin. Также величина предела обнаружения имеет одну и ту же размерность - концентрации - независимо от природы аналитического сигнала.

Стандартное отклонение холостого опыта рассчитывалось для семи последовательных измерений. Производили регистрацию отклика биосенсора на 50 мкл дистиллированной воды. Ответ сенсора определяли как первую производную отклика.

Результаты холостого опыта приведены в таблице 8. Расчеты минимального предела обнаружения приведены в приложении 3.

Таблица 8 - Результаты холостого опыта биосенсора на основе иммобилизированных клеток Debaryamyces hansenii в пленку из сополимера ПВС с ПВП.

Таким образом, минимальный предел обнаружения ГГС биосенсором на основе клеток Debaryamyces hansenii иммобилизованных в ПВС составил 0,02 мг/дм3. минимальный предел обнаружения OECD составил 0,01 мг/дм3.

3.1.6 Нижняя граница определяемых содержаний

Для характеристики возможностей методики с точки зрения количественного анализа используют величину, называемую нижней границей определяемых содержаний (Cн). Это минимальное содержание компонента, которое можно определить с заданной степенью точности, характеризуемой предельно допустимой величиной относительного стандартного отклонения. Очевидно что Сн > Cmin.

Для нахождения Сн определили ряд значений стандартного отклонения при различных БПК Sr(БПК), по полученным значениям построили экспериментальную зависимость относительного стандартного отклонения от БПК (имеющую вид убывающей кривой - обычно близкой к гиперболе) и нашли БПК, начиная с которой величины Sr(БПК) становятся меньше, чем заданное предельное значение Sr(C)max = 0,33[64].

Нижняя граница определяемых содержаний по ГГС

Для расчета нижней границы использовали грудуировку в коордринатах ответ сенсора - БПК. Пересчет проводили по формуле:

БПК=0,687×С(ГГС)

Детальный расчет нижней границы определяемых содержаний приведен в приложении 3.

На рисунке 22 представлен результат аппроксимации зависимости относительного стандартного отклонения от БПК(ГГС)

Рис. 22 - Экспериментальная зависимость относительного стандартного отклонения ответа биосенсора от БПК (ГГС)

Нижняя граница определяемых содержаний для ОЕСD

На рисунке 23 представлен результат аппроксимации зависимости относительного стандартного отклонения от БПК (ОЕСD)

Рис. 23 - Экспериментальная зависимость относительного стандартного отклонения ответа биосенсора от БПК (ОЕСD)

Таким образом нижняя граница определяемых содержаний БПК на основе ГГС-стандарта составила 0,157 мл О2/дм3, а нижняя граница определяемых содержаний БПК на основе OECD-стандарта составила 0,05 мл О2/дм3.

Применение OECD-стандарта позволит анализировать образцы с очень низким значением БПК.

Рабочий диапазон

Для любого аналитического метода важно знать диапазон концентраций определяемого вещества, в котором этот метод работает - рабочий диапазон. Рабочий диапазон определяется из калибровочной зависимости биосенсора. Рабочий диапазон не всегда ограничен лишь линейным участком, но для снижения ошибок анализа ограничиваются использованием линейного участка калибровочной зависимости (линейный диапазон).

Для калибровочных зависимостей гиперболического вида линейный диапазон ограничен снизу нижней границей определяемых содержаний, сверху - концентрацией, равной КМ. Так для биосенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от концентрации ГГС составил 0,23 - 44 мг/дм3. Учитывая, что теоретическая зависимость БПК от концентрации ГГС имеет вид: БПК = 0,687×С, линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от БПК составил 0,16 - 30 мг/дм. Для биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii иммобилизированного в модифицированный ПВС линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от БПК (ОЕСD-синтетических сточных вод) составил 0,05 -1,21мг/дм3 .

При калибровке БПК-датчика по ГГС-стандарту диапазон линейности в 30 раз превышает диапазон линейности в случае калибровки по OECD-синтетическим сточным водам.

3.2 Экспрессность биосенсора

Важной аналитической характеристикой любого метода является его экспрессность, т.е. быстрота проведения анализа. Временные затраты метода определяются в первую очередь длительностью единичного измерения. Для биосенсора этот параметр складывается из времени развития ответа и времени восстановления активности рецепторного элемента (промывки сенсора). Для биосенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в ПВС, на развитие ответа сенсора требуется 1-2 минуты в зависимости от концентрации субстрата, время восстановления активности рецепторного элемента после измерения (промывание) - 3-5 минут. Таким образом, длительность одного измерения 4-7 минут.

3.3 Анализ образцов вод

Проведен анализ реальных образцов воды и полупродуктов брожения с использованием разработанного макета БПК-биосенсора и стандартным методом разбавления.

Определение БПК5 образцов вод стандартным методом разбавления проводилось согласно действующим в РФ нормативным документам [61]. Содержание растворенного кислорода до и после пятидневной инкубации определялось с помощью анализатора жидкости «Эксперт - 001».

3.3.1 Анализ образцов, калибровка БПК-датчика по ГГС-стандарту

Для определения БПК анализируемых образцов воды по ГГС-стандарту с помощью биосенсора на основе клеток Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС была построена градуировочная зависимость в координатах ответ сенсора - БПК:

БПК = 0,68×C(ГГС)= 0,031C(ГГС) +0,12

После ряда математических операций было получено уравнение зависимости ответа сенсора от БПК:

БПК = 22,14R-2,67

Рис. 24 - Зависимость ответа сенсора от БПК по ГГС

Образцы воды (Упа, парк, талые) анализировали без предварительного разбавления. Объем вносимых образцов (Упа и талые воды) составил 200 мкл, а для образца «парк» - 400 мкл.

При непосредственном определении БПК с помощью биосенсора проводили предварительное разбавление образцов браги. Величина разбавления подбиралась таким образом, чтобы ответ сенсора лежал внутри линейного участка калибровочной зависимости. Для образца браги №1 проведено разбавление в 50 раз, образца браги №2 - 70 раз, образца браги №3 - 85 раз, а для образца №4 - 25 раз. Объем образцов вносимых в кювету составил 250 мкл.

3.3.2 Анализ образцов, калибровка БПК-датчика по OECD-стандарту

Аналогично, для определения БПК по ОЕСD сточных вод с помощью биосенсора на основе иммобилизованных клеток Debaryamyces hansenii была построена градуировочная зависимость в координатах ответ сенсора - БПК:

= 0,56БПК +0,03

БПК = 1,77 R - 0,05

Рис. 25 - Зависимость ответа сенсора от БПК по OECD

Образцы воды (Упа, парк, талые) анализировали без предварительного разбавления. Объем вносимых образцов составил 100 мкл.

При непосредственном определении БПК5 с помощью биосенсора проводили предварительное разбавление образцов браги. Величина разбавления подбиралась таким образом, чтобы ответ сенсора лежал внутри линейного участка калибровочной зависимости. Для образца браги №1 проведено разбавление в 50 раз, образца браги №2 - 70 раз, образца браги №3 - 85 раз, а для образца №4 - 25 раз. Объем образцов вносимых в кювету составил 100 мкл.

Результаты измерения БПК анализируемых образцов с использованием биосенсора на основе клеток Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС, представлены в таблице 9

Таблица 9 - Результаты измерения БПК полученные с использованием биосенсора и стандартным методом