Материал: Молекулярно-генетическая характеристика рекомбинантных форм вируса иммунодефицита человека 1 типа, выявленных на территории Республики Беларусь

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

.1 Характеристика образцов

В работе использовались образцы сыворотки/плазмы крови, полученные от ВИЧ-инфицированных пациентов, состоящих на учете в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) Республики Беларусь, а также от пациентов, у которых впервые выявлена ВИЧ-инфекция в лаборатории диагностики ВИЧи сопутствующих инфекций РНПЦ эпидемиологии и микробиологии. Образцы были получены в рамках исследований на определение резистентности ВИЧ-1 к антиретровирусным препаратам, молекулярно-генетического скрининга, количества вируса (вирусной нагрузки) и маркеров ВИЧ-инфекции. Всего проанализировано более 2000 образцов сыворотки/плазмы крови, поступивших в лабораторию в 2008-2015 гг., для исследования на наличие маркеров ВИЧ-инфекции и определения вирусной нагрузки. С целью выявления рекомбинантных форм вработе было использовано 302сиквенса участка гена polВИЧ-1, полученных в лаборатории диагностики ВИЧи сопутствующих инфекций начиная с 1996 г.и зарегистрированных в Genbank. Один сиквенс, изолят 98BY10443, был взят из Genbank (AF414006.1). Данный сиквенс получен А. Е. Машарским от ВИЧ-инфицированного пациента из г. Могилева, который заразился парентеральным путем в г. Калининграде, Россия[182].

Таким образом, в диссертационной работе использовано 303 сиквенса участка гена pol и полноразмерного генома ВИЧ-1.Основные данные по пациентам, от которых получены образцы крови, представлены вприложении А.

Получение сыворотки/плазмы крови

Плазма/сыворотка крови для проведения вирусологических и молекулярно-генетических исследований была поучена путем центрифугирования цельной крови, содержащей/не содержащей ЭДТА, при 3000 об/мин в течение 15 минут. Хранение сыворотки/плазмы осуществлялось в завинчивающихся одноразовых пробирках объемом 1,5-2,0 мл при температуре минус 70 ℃.

.2 Скрининг сыворотки/плазмы крови на наличие маркеров ВИЧ-инфекции

Скрининг сыворотки/плазмы крови методом иммуноферментного анализа использовался для первичной диагностики ВИЧ-инфекции в поступивших образцах при условии, что диагноз ВИЧ-инфекции не был предварительно установлен в других ЛПУ Республики Беларусь.

Для выявления серологических маркеров ВИЧ-инфекции использовались наборы реагентов для иммуноферментного выявления антител к ВИЧ-1,2 и антигена р24 ВИЧ: КомбиБест ВИЧ-1,2 АГ/АТ (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) и набор реагентов для иммуноферментного выявления и подтверждения наличия антигена р24 ВИЧ: ВИЧ р24-антиген-ИФА-БЕСТ (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), согласно прилагаемым к наборам инструкциям.

Количественное определение РНК ВИЧ

В исследуемых образцах при наличии подтвержденной ВИЧ-инфекции и/или серологических маркеров ВИЧ-инфекции определялось количество РНК ВИЧ(вирусная нагрузка) с использованием набора реагентов для выявления и количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени: РеалБест РНК ВИЧколичественный (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) на амплификаторе CFX96 (BioRad, США), согласно прилагаемой к набору инструкции.

Для экстракции РНК и последующего синтеза ДНК ВИЧиспользовались образцы с вирусной нагрузкой не менее 2000 копий РНК ВИЧна 1 мл сыворотки/плазмы крови.

Выделение РНК ВИЧ

Выделение РНК ВИЧпроводилось с использованием коммерческих наборов различных производителей, согласно прилагаемым к ним инструкциям:

1.       ViroSeq Sample Preparation Module (Abbott Molecular, США). Объем плазмы крови - 0,5 мл;

.         Рибо-Сорб (АмплиСенс, Россия). Объем сыворотки/плазмы крови - 0,1 мл;

.         Рибо-Преп (АмплиСенс, Россия). Объем сыворотки/плазмы крови - 0,1 мл.

Полученная РНК хранилась в пробирках объемом 0,6 мл при температуре минус (20-70) ℃.

Определение участка генома ВИЧдля секвенирования
и филогенетического анализа

С целью определения участка секвенирования генома ВИЧдля последующего генотипирования и филогенетического анализа был осуществлен анализ всех имеющихся референсных последовательностей ВИЧв международной базе данных сиквенсов ВИЧHIV sequence database(#"896330.files/image007.jpg">

Для амплификацииучастка гена polсобственными праймерами были подобраны пары праймеров, позволяющие синтезировать участок, кодирующий протеазу и 2/3 участка, кодирующего обратную транскриптазу ВИЧ. Размер амплифицируемого фрагмента генома ВИЧ-1 составил порядка 1500 п.н. (рисунок 2.2).

Таблица 2.2.- Пары праймеров для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ

Праймер для обратной транскрипции.

Праймер для первого раунда ПЦР.

Праймер для второго раунда ПЦР.

Синтез полноразмерного генома ВИЧ

Для амплификации полноразмерного генома ВИЧ-1 были использованы пары праймеров, позволяющие амплифицировать все структурные гены вируса, а также часть 5’- и 3’-LTR ВИЧ. Данные пары праймеров условно делят геном ВИЧ-1 на 4 перекрывающихся фрагмента, обозначенных A, B, C и D(рисунок 2.3).

Нуклеотидные последовательности праймеров для амплификации полноразмерного генома ВИЧ-1 и их координаты относительно HXB2 указаны в таблице 2.3.

Таблица 2.3. - Пары праймеров, использованные для амплификации полноразмерного генома ВИЧ

Праймер для обратной транскрипции.

Праймер для первого раунда ПЦР.

Праймер для второго раунда ПЦР.

Обозначения:

→ - прямой праймер.

← - обратный праймер.

Регистрация продуктов амплификации

Детекция продуктов амплификации проводилась методом горизонтального электрофореза в 1,7%-ном агарозном геле (Sigma, США). Буфер для нанесения использовался DNA Gel Loading Dye (6X) (Thermo Fisher, США). Электрофорез проводился в горизонтальной камере для электрофореза.Электрофоретический буфер - 0,5 TAE (20 ммоль Трис, 10 ммоль уксусная к-та, 0,5 ммоль ЭДТА), напряжение электрического поля - 10 В/см расстояния между электродами, время проведения электрофореза - 18 минут. В качестве интеркалирующего красителя ДНК использовался бромистый этидий. Регистрация ДНК проводилась в проходящем УФ-свете (312 нм) трансиллюминатора UVT-1 (Россия). Длина амплифицированных фрагментов определялась относительно маркера молекулярного веса - 100-1500 п.н. с шагом 100 п.н. (различных производителей). Положительными считались образцы, которые имели полосу на геле на уровне, соответствующем размеру амплифицируемого фрагмента.

Очистка продуктов амплификации после ПЦР

Для проведения секвенирующей ПЦР положительные образцы очищались от остатков праймеров, дНТФ и ДНК-полимеразы с использованием наборов QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, США) и Clean Up Enzyme Mix (Abbott Molecular, США), согласно инструкциям к применению наборов.

Секвенирующая ПЦР

Реакция секвенирования проводилась по методу Сэнгера [183]с использованием терминаторов BigDye Termination Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems®, США), а также специфических праймеров для амплификации ДНК ВИЧ,согласно инструкции к применению набора.

Очистка продуктов амплификации после секвенирующей ПЦР

Амликоны после секвенирующей ПЦР очищались методом преципитации ДНК с ацетатом натрия. Для этого готовилась смесь холодного (-20 ºС) 96%-ного этанола и 3-молярного ацетата натрия объемом 50 мкл и 2 мкл на образец соответственно. К смеси добавлялось 20 мкл продукта амплификации, после чего смесь центрифугировалась при следующих условиях: время 30 мин, температура +4 ºС, скорость 13 000 g. Супернатант удалялся и осадок промывался холодным (-20 ºС) 70%-ным этанолом с последующим центрифугированием: время 5 мин, температура +20 ºС, скорость 13 000 g. Далее супернатант удалялся и осадок высушивался при 95 ºС в течение 2 мин. Высушенный осадок растворялся в 20 мкл формамида Hi-Di™ Formamide (Applied Biosystems®), после чего прогревался при 95 ºС в течение 2 мин.

Получение электрофореграмм и сборка контига

Электрофореграммы исследуемых образцов были получены на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM® 3100-Avant™ Genetic Analyzer (Applied Biosystems®).Анализ электрофореграмм и сборка контига осуществлялись с помощью программного обеспечения Sequencing Analysis Software™ (Applied Biosystems®) и Geneious® v8 (Biomatters Ltd.).

Выравнивание последовательностей нуклеотидов

Множественное выравнивание последовательностей нуклеотидов (multiple sequence alignment) проводилось с помощью алгоритма ClustalW alignment [184] и MAFFT [185, 186].

Получение референсных сиквенсов

Поиск генетически близких референсных сиквенсов ВИЧосуществлялсяс помощьюBLAST (Basic Local Alignment Search Tool, #"896330.files/image008.jpg">

С целью проверки внутрисубтипной рекомбинации для первых 400 нуклеотидов всех исследуемых CRF03_AB, относящихся к субтипу А ВИЧ, были найдены 10 наиболее генетически близких референсов онлайн-программой BLAST. Результаты поиска показали, что все найденные референсы относятся к варианту ВИЧ-1 AFSU, получившему распространение на территории стран бывшего СССР, включая Беларусь. Не было выявлено ни одного анцестрального референсного сиквенса, с которым могла быть внутрисубтипная рекомбинация, как это было установлено программой REGA. Такой результат может быть обусловлен некоторыми заменами нуклеотидов в сиквенсах исследуемых образцов, что делает их генетически ближе к консенсусному сиквенсу субтипа А1, генетически отличного от варианта ВИЧ-1 АFSU, из генома которого состоят сегменты субтипа А1 в CRF03_AB. Таким образом,исследуемые образцы Mg_15 и MnObl_61 являются «чистыми» CRF03_AB.

Образцы Mn_8 и PV_29 были идентифицированы программой REGA как рекомбинантные формы между субтипами B и D ВИЧ, однако другие методы генотипирования не подтвердили наличия вставки генома субтипа D. Как и в случае с образцами Mg_15 и MnObl_61, такой результат получился из-за единичных изменений в геноме исследуемых образцов, что сделало их генетически ближе к ВИЧ-1 субтипа D в середине генома. При визуальном анализе нуклеотидных и аминокислотных последовательностей референсных сиквенсов субтипов B и D ВИЧ-1 и исследуемых образцов в участке рекомбинации не было выявлено существенных отличий Mn_8 и PV_29 от консенсусных сиквенсов субтипа В.

При филогенетическом анализе образец Mn_21 кластрировался вместе с образцами ВИЧ-1 субтипа А1 варианта AFSU, однако программы REGA и jpHMM показали наличие вставок ВИЧ-1 субтипа B, отличных от CRF03_AB, идентифицировав, таким образом, уникальную рекомбинантную форму ВИЧ. Подробнее о ней написано в главе 5 данной работы.

При генотипировании образца Mg_3 с использованием программ COMET, REGA и jpHMM было определено, что данный образец является субтипом G ВИЧ. Однако при построении филогенетического дерева образец Mg_3 оказалсяв субкластере с циркулирующей рекомбинантной формой CRF43_02G. В то же время варианты циркулирующей рекомбинантной формы CRF43_02G, находящиеся в Genbank, формировали между собой отдельный суб-субкластер (Приложение Б). Анализ точек рекомбинации показал, что точка разрыва генома CRF43_02G находится в позиции 3325, то есть начиная с нуклеотида 3325 начинается последовательность генома циркулирующей рекомбинантной формы CRF02_AG.

В свою очередь, CRF02_AG имеет разрыв генома в координате 3275, начиная с которой геном ВИЧ-1 представлен субтипом А(рисунок 3.4).

С целью проверки, содержит ли образец Mg_3 геном субтипа А, был проведен визуальный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей Mg_3 в алайменте с референсными сиквенсами ВИЧ-1 субтипов A и G. В результате выявлен только один нуклеотид А в позиции 3439, который характерен для субтипа А (А1 и А2), в то время как у ВИЧ-1 субтипа G в данной позиции находится нуклеотид С(рисунок 3.5).

Данная позиция является второй в триплетном коде аминокислоты, и в случае нахождения нуклеотида С образуется триплет GCR, кодирующий аминокислоту аланин. Нуклеотид А в триплете RAR кодирует аминокислоты лизин или глутаминовую кислоту, являющиеся консенсусными для субтипа А. Все остальные нуклеотидные и аминокислотные последовательности образца Mg_3 относились к субтипу G. Таким образом, образецMg_3 был определен как ВИЧ-1 субтипа G.

В большинстве случаев все различные методы генотипирования ВИЧ-1 дают одинаковые результаты.Различиярезультатов, вероятнее всего, обусловлены различными алгоритмами генотипирования образцовВИЧ-1 (филогенетический анализ, бутскан-анализ) и/или различными консенсусными сиквенсами, с которыми сравнивается исследуемый образец.

Распространенность субтипов ВИЧ-1 на территории Беларуси

Проведенные исследования по генотипированию показали, что ВИЧ-1 субтипа А1 в анализируемый период оставался доминирующим на территории Беларуси. На его долю среди всех исследованных 303 образцов ДНК приходилось 275 случаев, что составляло 90,7%. Кроме субтипа А1, было выявлено 9 случаев инфицирования ВИЧ-1 субтипа В (3,0%), по 2 случая приходилось на инфицирование субтипами ВИЧ-1 С и G (по 0,7%). В 15 (4,9%) образцах были выявлены рекомбинантные формы ВИЧ. Более половины случаев от всех обнаруженных рекомбинантных форм приходилось на CRF03_AB - 8 (2,6%), на CRF02_AG - 4 (1,3%), на CRF06_cpx - 2 (0,7%) и в одном случае выявлена уникальная рекомбинантная форма (УРФ) ВИЧ-1 между субтипами A1 и B(таблица 3.6).

Таблица 3.6. - Распределение субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1 по сумме результатов генотипирования различными методами

Наибольшее распространение ВИЧ-1 субтипа А1 было выявлено у ПИН - 119 из 275 (43,2%), средний возраст данной группы пациентов составил 33,7±5,8 лет. На втором месте - лица, инфицированные половым путем - 102 пациента (33,7%), средний возраст составил 31,4±8,0 лет. В 42 случаях материал был получен от детей в возрасте до 18 лет, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Не удалось установить путь инфицирования в 12 случаях.

ВИЧ-1 субтипа Bвыявлялся, главным образом, у лиц, инфицированных половым путем - 6 из 9 случаев, включая 2 МСМ. Средний возраст пациентов в данной группе составил 32,5±8,0 лет. В одном случае субтип В был выявлен у ПИН, мужчины 1976 г.р. из г. Орши Витебской области. В двух случаях образцы крови были получены от лиц, явившихся реципиентами крови от ВИЧ-инфицированного пациента. Это женщина 1929 г.р. и мужчина 1947 г.р., (образцы PV_31 и PV_30 соответственно), проживающие в г. Витебске.