Материал: Молекулярно-генетическая характеристика рекомбинантных форм вируса иммунодефицита человека 1 типа, выявленных на территории Республики Беларусь

Стоит обратить внимание на патристические дистанции между образцами Gr_3/Gr_8 и MnObl_15/Mg_8. Так, дистанция между Gr_3 и Gr_8 составила 0,002, в то время как между MnObl_15 и Mg_8 - 0,034, кроме того, между MnObl_15 и Mg_8 не обнаружено никаких эпидемиологических связей. Все это дает основание утверждать, что в Беларуси циркулирует еще как минимум один вариант CRF03_AB, генетически близкий к сиквенсам и, вероятно, имеющий эпидемические связи с образцами MnObl_15 и Mg_8.

Как было отмечено в данном разделе, субтип ВИЧ-1 уреференсных сиквенсов установлен не всегда верно. Все найденные референсные сиквенсы в данном исследовании являются CRF03_AB.Однако, как видно на филогенетическом дереве(рисунок 4.6),в базы данных многие из них загружены как ВИЧ-1субтипаB.

Циркулирующая рекомбинантная форма CRF06_cpx

Два случая инфицирования рекомбинантной формойCRF06_cpxвыявлены в 2008 г. у близких родственников, брата и сестры - 28 и 30 лет соответственно, проживавших в г. Логойске Минской области.Оба пациента, MnObl_27 и MnObl_28, были инфицированы парентеральным путем.

Молекулярно-генетическаяхарактеристикаCRF06_cpx

Для сравнения структуры геномов выявленных CRF06_cpx был взят референсный штамм BFP90 (Genbank: AF064699). Координаты рекомбинаций образцов MnObl_26, MnObl_27 и BFP90 получены с помощью программы jpHMM. Дополнительно структура генома BFP90, установленная в 2002 г., была взята из HIV sequence database (BFP90*). Структуры геномов данных сиквенсов показаны на рисунке 4.8. Программа jpHMMпоказала, что в структуре генома образца MnObl_26 содержатся фрагменты геномов ВИЧ-1 субтипов G, Bи C. Образец MnObl_27 содержит фрагменты геномов ВИЧ-1 субтипов Gи C, как и у референсного сиквенса BFP90, и не содержит фрагментов субтипа B. Стоит отметить, что часть геномов у всех образцов является неопределяемой (N/A), то естьв данном участке генома программа не смогла установить родительский субтип ВИЧ.

Дополнительно был проведен сравнительный анализ нуклеотидных и их транслированных аминокислотных последовательностей образцов MnObl_26 и MnObl_27 cреференсными сиквенсами, полученными с помощью программы BLASTдля филогенетического анализа. Замечено, что генетической особенностью выявленных рекомбинантных форм CRF06_cpx, а также CRF06_cpx, получивших распространение в Эстонии, является инсерция аминокислот серина или аспарагина в положении 38 гена polВИЧ-1 по сравнению с другими референсными сиквенсами CRF06_cpx(рисунок 4.9).

Определение направлений заноса и распространения CRF06_cpxна территории Беларуси

Для проведения филогенетического анализа выявленных на территории Беларуси двух CRF06_cpx с помощью программы BLASTосуществлен поиск 20 генетически близких референсных сиквенсов для каждого из исследуемых образцов. После удаления повторяющихся все сиквенсы были объединены в алаймент, содержащий 19референс-сиквенсов и 2 выявленных CRF06_cpx. Длина алаймента составила 1417 п.н. Результат филогенетического анализа показан на рисунке 4.10.

Как видно изрисунка 4.10, исследуемые образцы MnObl_27 и MnObl_28 сформировали кластерс референсными сиквенсами из Эстонии, значение SH-aLRTкластера составило 1. Кроме этого, оба исследуемых образца сформировали субкластер между собой, значение SHкоторого 0,904, что свидетельствует об одном источнике их происхождения. Таким образом, по результатам филогенетического анализа, занос CRF06_cpxна территорию Беларуси следует считать единичным событием. Дальнейшей передачи вируса внутри страны в ходе молекулярно-эпидемиологического скринига выявлено не было.

Мутации резистентности и чувствительность к АРП
выявленных рекомбинантных форм ВИЧ-1

Путем анализа нуклеотидных последовательностей участка гена pol исследуемые образцы были проанализированы на наличие мутаций резистентности и чувствительности к трем группам АРП: ИП, НИОТ и ННИОТ.

Мутации резистентности к АРП

Среди 15 рекомбинантных форм ВИЧ-1 мутации резистентности выявлены у 7 образцов(таблица 4.4).

Таблица 4.4. - Мутации резистентности к АРП, выявленные в рекомбинантных формах ВИЧ-1 на территории Беларуси

* K20I - не является мутацией резистентности у ВИЧ-1 субтипа G и рекомбинантных формах, содержащих фрагмент ВИЧ-1 G в сегменте, кодирующем протеазу, поскольку изолейцин (I) - консенсусная аминокислота в данном положении.

Образец RES_649содержал мутации резистентности ко всем трем группам АРП. Мутации ИП M46I, L76V привели к высокому уровню резистентности к фосампренавиру, к индинавиру, лопинавиру и нелфинавиру выявлен средний уровень резистентности и низкий - к дарунавиру. Мутации M41L, D67E, V75M, M184V, L210W, T215Y привели к высокому уровню резистентности ко всем препаратам группы НИОТ, а мутации V90I, K103N, E138Q, K238T - к различному уровню резистентности ко всем препаратам группы ННИОТ. Так, к препаратам эфавиренцу и невирапину выявлен высокий уровень резистентности, к рилпивирину - низкий уровень, к этравирину - потенциальный низкий уровень резистентности.

В геноме изолята FN995208 не было выявлено мутаций резистентности высокого уровня к ИП. Мутации M184V, K103S и G190A, определенные в участке гена pol, кодирующем фермент обратную транскриптазу, ведут к высокому уровню резистентности ко всем ингибиторам обратной транскриптазы, за исключением двух ННИОТ: этравирина и рилпивирина, к которым наблюдается низкий уровень устойчивости вируса. Таким образом, для данного пациента была необходима корректировка схемы лечения с включением других групп препаратов, таких как ингибиторы интегразы и/или ингибиторы слияния ВИЧ.

Изолят MnObl_27 оказался чувствителен ко всем препаратам из класса ИП, а также к зидовудину, ставудину и тенофовиру (НИОТ) и этравирину и рилпивирину (ННИОТ), но имел мутацию высокого уровня в положении M184V,ведущую к устойчивости к ламивудину и эмтрицитабину (НИОТ) и мутацию в положении K103N, ведущую к устойчивости к невирапину, делавирдину и эфавиренцу (ННИОТ).

MnObl_28 содержал 2 мутации, обе из которых привели к высокому уровню резистентности к препаратам ННИОТ эфавиренцу, делавирдину и невирапину.

Изолят RES_634 содержал только мутацию в положении M184V, которая приводит к высокому уровню резистентности к ламивудину и эмтрицитабину.

Высокий уровень резистентности к эфавиренцу/невирапину и низкий - к этравирину/рилпивирину группы ННИОТ, связанный с мутациями в положенииK103S и G190A,выявлен у изолята MnObl_61. К препаратам групп ИП и НИОТ данный изолят чувствителен.

В геноме изолята Mg_15 наблюдается такой же уровень резистентности к ННИОТ, связанный с мутациями K103N и G190A, как и у изолята MnObl_61, кроме этого, наличие мутации T74S в участке, кодирующем протеазу, приводит к низкому уровню резистентности к нелфинавиру.

Таким образом, в исследуемых образцах, за исключением RES_649, не наблюдается высокого уровня резистентности к препаратам ИП. Среди мутаций резистентности к НИОТ у всех резистентных форм выявляется мутация M184I, которая встречается у 64,4% пациентов с резистентностью к НИОТ в Беларуси. У двух пациентовRES_649 и FN995208 (CRF02_AG) диагностирована резистентность ко всем препаратам группы ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ. У всех пациентов, резистентных к ННИОТ и инфицированных ЦРФ ВИЧ, встречается мутация K103N/S, которая выявляетя в 45% случаев всех резистентных к ННИОТ пациентов в Беларуси.

Чувствительностьк АРП

Чувствительность исследуемых рекомбинантных форм к АРПгрупп ИП, НИОТ и ННИОТ указана в таблице 4.5.

Уровень чувствительности/резистентности к АРП определялся путем сравнения аминокислотных последовательностей исследуемого образца и дикого штамма ВИЧс известным уровнем чувствительности к АРП. Различают пять степеней резистентности к АРП.

Чувствителен - нет признаков снижения чувствительности к ВААРТ по сравнению с диким типом вируса.

Потенциальный низкий уровень резистентности - вирус, вероятно, полностью чувствителен к АРП, однако геном содержит мутации, которые могут указывать на предыдущие воздействия АРП.

Низкий уровень резистентности - вирус содержит мутации, которые могут приводить к снижению чувствительности вируса к АРП в условиях invitroи/или у пациентов при наличии таких мутаций может быть не оптимальный вирусологический ответ на лечение ВААРТ.

Средний уровень резистентности - чувствительность вируса к АРП ниже, чем при низком уровне резистентности, однако выше, чем при высоком уровне резистентности. АРП, к которым вирус имеет средний уровень резистентности, следует применять только в том случае, если АРП имеют высокий генетический барьер к резистентности (напр., некоторые ингибиторы в комбинации с ритонавиром) или при лимите других АРП.

Высокий уровень резистентности - мутации, выявляемые в сиквенсе вируса аналогичны тем, которые наблюдаются у вирусов с наиболее высоким уровнем лекарственной устойчивости invitro. Клинические данные показывают, что у пациентов, инфицированных вирусами, имеющими такие мутации, как правило, низкий уровень ответа или вообще нет вирусологического ответа на лечение АРП.

Таблица 4.5. - Уровень чувствительности выявленных рекомбинантных форм ВИЧ-1 к АРП

Обозначения:Susceptible Чувствителен    Potential low-level resistance Потенциальный низкий уровень резистентности      Low-level resistance Низкий уровень резистентности          Intermediate resistance Средний уровень резистентности    High-level resistance Высокий уровень резистентности

* В данном случае нет снижения уровня резистентности, поскольку снижение чувствительности в этом случае обусловлено заменой аминокислот Kна Iв положении 20 (мутация K20I), однако в геноме ВИЧ-1 субтипа G и рекомбинантных формах, содержащих фрагмент генома ВИЧ-1 субтипа Gв сегменте, кодирующем протеазу,изолейцин (I) является консенсусной аминокислотой в данном положении.

Таким образом, на основании проведенных в данной главе исследований можно сделать следующие выводы:

у пациентов с ВИЧ/СПИД, проживающих на территории Республики Беларусь, среди рекомбинантных форм ВИЧ-1 наиболее часто (53,3%) встречается CRF03_AB;

методом филогенетического анализа установлено шесть независимых событий заносаCRF03_AB на территорию Беларуси, два из которых привели к дальнейшему распространению данной рекомбинантной формыВИЧ-1 уже на территории страны. Первых два случая ВИЧ-инфекции CRF03_AB были связаны с потреблением инъекционных наркотиков на начальном этапе эпидемии ВИЧ-1 в 1996-1997 гг. (образцы 98BY10443 и MnObl_61). Последующие случаи инфицирования CRF03_AB обусловлены гетеросексуальным путем передачи;

отсутствие достоверных кластеров с тремя и более таксонами при филогенетическом анализе CRF03_AB свидетельствует о не связанных между собой событий заноса вируса на территорию страны, не приведших к локальным вспышкам ВИЧ-инфекции. Два выявленных случая CRF_03ABв г. Лиде были связаны с умышленным случаем гетеросексуальной передачи вируса ВИЧ-инфицированным партнером;

в четырех случаях (26,7%) ВИЧ-инфекции, вызванной рекомбинантными формами,выявлена CRF02_AG.Методом филогенетического анализа установлено три независимых события заноса данной ЦРФ на территорию страны: в двух случаях CRF02_AGбыла занесена в Беларусь с территории Западной Африки (образцы FN995208 и RES_649), в одном случае (Mn_59 и Mn_60, ВИЧ-инфицированные мать и ее ребенок) CRF02_AG- с территории Узбекистана;

в двух случаях ВИЧ-инфекции рекомбинантными формами (13,3%) выявлена CRF06_cpx. Методом филогенетического анализа установлено, что CRF06_cpxбыла занесена на территорию Беларуси из Эстонии из среды потребителей инъекционных наркотиков;

ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УНИКАЛЬНОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ФОРМЫ ВИЧ-1 MOS

В результате проведенных исследований по генотипированию и филогенетическому анализуобнаружена новая уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 (изолят Mos), имеющая в составе генома вставки последовательностей субтипов А1 и В вируса, но отличающаяся от известной циркулирующей рекомбинантной формы CRF03_AB. На описанную автором уникальную рекомбинантную форму - изолят Mos- получен патент № 18124, начало действия - 29.04.2011.

Молекулярно-генетическая характеристика УРФMos по участкам генов gag, polиenv