Материал: Молекулярно-генетическая характеристика рекомбинантных форм вируса иммунодефицита человека 1 типа, выявленных на территории Республики Беларусь

ВИЧ-1 субтипа С выявлен у семейной пары - образцы Mn_22 и Mn_39. Оба партнера были инфицированы половым путем, один из которых явился источником вируса для другого партнера.

Субтип Gбыл определен в образцах Mg_3 - женщины 1986 г.р. из г. Могилева и RES_646 - мужчины 1983 г.р. из г. Барановичи, который был инфицирован половым путем.

Рекомбинантные формы ВИЧ-1 были выявлены у пациентов с различным путем инфицирования. УРФ Mosи 2 ЦРФ CRF02_AGбыли определены у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, у ПИНв 3 случаях были выявлены CRF03_ABи в 2 - CRF06_cpx. Наибольшее количество случаев ВИЧ-инфекции рекомбинантными формами ВИЧ-1 было определено среди лиц, инфицированных половым путем - 5 случаев инфицирования CRF03_ABи 2 случая - CRF02_AG.

Таким образом, по проведенным в данной главе молекулярно-генетическим исследованиям можно сделать следующие выводы:

на территории Республики Беларусь в популяции пациентов с ВИЧ/СПИД за анализируемый период 2008-2015 гг. доминировал ВИЧ-1 субтипа А1, на который приходилось 90,7% от 303 проанализированных сиквенсов ДНК по участку гена pol. Данный субтип передавался как парентерально при внутривенном введении наркотиков (43,2%), так и половым путем (33,7%). Средний возраст этих групп пациентов составил 33,7 и 31,4 лет соответственно;

рекомбинантные формы ВИЧ-1 по частоте встречаемости находись на втором месте - 4,9% (15) от всех проанализированных последовательностей ДНК. Более половины случаев от всех обнаруженных рекомбинантных форм приходилось на CRF03_AB - 8 (2,6%), на CRF02_AG - 4 (1,3%), на CRF06_cpx - 2 (0,7%) и в одном случае выявлена уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 между субтипами A1 и B;

субтип В был выявлен в 9 (3%) случаях ВИЧ-1-инфекции, субтипы Cи G - в двух случаях каждый (по 0,7% каждый).

ГЛАВА 4. РЕКОМБИНАНТНЫЕ ФОРМЫ ВИЧ-1, ВЫЯВЛЕННЫЕ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

На следующем этапе исследований предстояло выяснить происхождение рекомбинантных форм ВИЧ-1. Являются ли они результатом заноса из-за пределов страны, либо рекомбинантные события в геноме вируса произошли на территории Республики Беларусь.

На основании сиквенсов гена pol, а также секвенирования полноразмерного генома было выявлено 15 случаев ВИЧ-инфекции, вызванных рекомбинантными формами ВИЧ-1. Более половины всех случаев (8 из 15) приходилось на CRF03_AB, четыре случая вызваны CRF02_AG, два случая - CRF06_cpx. В одном случае выявлена уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 между субтипами А1 и В, данные по выявленным рекомбинантным формам представлены в таблице 4.1.

Таблица 4.1. - Рекомбинантные формы ВИЧ-1, выявленные в Беларуси

Циркулирующая рекомбинантная форма CRF02_AG

Первый случай инфицирования рекомбинантной формой CRF02_AG был выявлен в 2003 г. в Могилевской области у ребенка, рожденного ВИЧ-инфицированной матерью. Материал от матери и отца ребенка в лабораторию диагностики ВИЧи сопутствующих инфекций не поступал, поэтому можно предположить, что как минимум еще два случая ВИЧ-инфекции CRF02_AGв настоящее время остаются не зарегистрированными - у матери и отца ребенка. В 2014 г. в г. Минске были выявлены еще 2 случая ВИЧ-инфекции, связанные с рекомбинантной формой CRF02_AG, - у матери 1986 г.р. и ее ребенка 2012 г.р. Последний, на начало 2016 г., случай инфицирования CRF02_AGвыявлен также в г. Минске у мужчины 1966 г.р.

Молекулярно-генетическая характеристикаCRF02_AG

Структуры геномов рекомбинантных форм CRF03_AB, выявленных на территории Беларуси, показаны на рисунке 4.1. В качестве эталонного образца использован референснойштамм IbNG (Genbank: L39106).

Как видно из рисунка 4.1, структуры геномов исследуемых образцов совпадают с референсной CRF02_AG. Все образцы содержат фрагменты субтипа G в начале гена polдлинойпорядка 1000 п.н., за которым следует фрагмент субтипаA. Стоит отметить, что из-за короткой длины нуклеотидов в начале анализируемого участка перед фрагментом субтипа GпрограммаjpHMM не всегда смогла установить, к какому субтипу принадлежат первые 40-60 нуклеотидов(таблица 4.2).

Таблица 4.2. - Координаты фрагментов субтипов исследуемых образцов CRF02_AG, полученных с помощью программы jpHMM. Координаты указаны относительно HXB2

Для сравнительного анализа между собой и консенсусным сиквенсом CRF02_AGIbNGчетыресиквенса были объединены в один алаймент относительно IbNG и выравнены по длине.Длина алаймента составила 1422 нуклеотида, из которых 1212(85,2%)былиидентичнымиреференсу сайта.Попарная идентичность (pairwise identity) между сиквенсами составила 93,1%.геном вирус иммунодефицит кровь

Для установления происхождения рекомбинантной формы CRF02_AG методом филогенетического анализа был осуществлен поиск 10 генетически близких сиквенсов с применением программы BLAST для каждого из исследуемых образцов, при этом их сиквенсы были укорочены до 1011 п.н. После удаления повторяющихся референсов создали алаймент, содержащий 39 референсных последовательностей и четыре исследуемых образца. Длина алаймента составила 1011 п.н.

Как видно из данных, представленных на рисунке 4.3, на филогенетическом дереве исследуемые образцы образовали 3 независимых достоверных кластера, что говорит о трех разных событиях заноса данной рекомбинантной формы на территорию Беларуси.Образец RES_649 сформировал кластер с референсами из Нигерии, Буркина-Фасо, Сенегала и Великобритании (рисунок 4.3, кластер 1). Топология таксонов внутри данного кластера указывает на то, что сиквенсы RES_649 и 66051 из Великобритании произошли от референса ORAV232 из Буркина-Фасо, однако значение SH-aLRTэтой группы сиквенсов составляет всего 0,789, поэтому с уверенностью данное предположение утверждать нельзя. Если обратиться к географии данных стран, то можно обнаружить, что Нигерия, Буркина-Фасо и Сенегал географически расположены рядом, на северо-западе африканского континента, а принимая во внимание, что значение SH-aLRTкластера 1 составляет 0,946, можно утверждать, что образец RES_649 был занесен на территорию Беларуси с северо-запада африканского континента.

Что касается референса из Великобритании, то эпидемические данные в Genbankпо данному сиквенсу отсутствуют и, вероятнее всего, сиквенс был получен из образца крови, взятого у мигранта с африканского континента.

Образец FN995208 на филогенетическом дереве сформировалидостоверный кластер с референсами из Камеруна(рисунок 4.3, кластер 2), значение SH-aLRTсоставило0,966. В данный кластер также входит один референс из Демократической Республики Конго. По результатам филогенетического анализа можно достоверно утверждать, что FN995208 имеет «африканского» предка из Камеруна и не связан с рекомбинантными формами A/G, получившими распространение на территории стран бывшего СССР.

Образцы Mn_59 и Mn_60 находятся в кластере, сформированномреференсными сиквенсами ВИЧ-1 из Узбекистана(рисунок 4.3, кластер 3), которые, в свою очередь, были изолированы и секвенированы от ВИЧ-инфицированных пациентов, вовлеченных во вспышку в этой стране, связанной с Западно-Африканской рекомбинантной формой CRF02_AG [197]. Кластрирование образцов Mn_59 и Mn_60 с данными референсами достоверно указывает на то, что данный вирус был занесен в Беларусь с территории Узбекистана. Кроме этого,изоляты Mn_59 и Mn_60 образуют кластер между собой со значением SH-aLRT - 0,998, патристическая дистанция между этими образцами составляет всего 0,005, что свидетельствует об их крайне высокой генетической гомогенности и происхождении из одного источника. Результаты филогенетического анализа подтверждают и эпидемиологические данные, что ребенок,Mn_59, был рожден своей ВИЧ-инфицированной матерью, Mn_60.

Циркулирующая рекомбинантная форма CRF03_AB

Впервые CRF03_AB на территории Беларуси была идентифицирована в 2000 г. Данный образец получили от ВИЧ-инфицированного пациента из г. Могилева, который заразился парентеральным путем в г. Калининграде, Россия. Первоначально данный образец был идентифицирован как ВИЧ-1 субтипа B, однако дальнейшие исследования А. Е. Машарского совместно с В. Ф. Ереминым достоверно показали, что образец 98BY10443 представляет собой рекомбинантную форму ВИЧ-1 CRF03_AB [182].Другой случай, связанный с рекомбинантной формой CRF03_AB, был выявлен в 2008 г. в г. Жодино Минской области у пациента 33 лет. Данный случай также был связан с внутривенным употреблением наркотиков. В 2010 г. выявлено сразу 4 случая инфицирования CRF03_AB, и все были обусловлены половым путем передачи вируса. Два из этих случаев были выявлены в г. Лиде Гродненской области - у мужчины 29 лет и женщины 27 лет, один случай выявили в г. Любани Минской области у женщины 29 лет и еще один- в г. Бобруйске Могилевской области, так же у женщины в возрасте 31 года. В 2013 г.CRF03 была выявлена у 41-летней женщины из г. Осиповичи Могилевской обл., и последний случай инфицирования CRF03_ABвыявлен в августе 2015 г. у 38-летнего мужчины из г. Дзержинска Минской области.

Молекулярно-генетическая характеристика CRF03_AB

Структура геномов рекомбинантных форм CRF03_AB, выявленных на территории Беларуси, показана на рисунке 4.4. Координаты точек рекомбинации получены с помощью программы jpHMM, в качестве референсногообразца использован штамм Kal153 (Genbank: AF193276).

Как видно из рисунка 4.4, все выявленные на территории Беларуси CRF03_AB имели структуру, идентичную референсному штаммуKal153, полученному от пациента, проживавшего в г. Калининграде, Россия. Координаты точек рекомбинации у всех образцов находились в диапазоне координат 2667-2773, у референсного штаммаKal153 - в точке с координатой 2688, относительно HXB2. Не было выявлено вставок фрагментов геномов других субтипов ВИЧ-1.Координаты фрагментов субтипов исследуемых образцов CRF03_AB, полученных с помощью программы jpHMM приведены в таблице 4.3.

Таблица 4.3 - Координаты фрагментов субтипов исследуемых образцов CRF03_AB, полученных с помощью программы jpHMM. Координаты указаны относительно HXB2

Для сравнительного анализа между собой и консенсусным сиквенсом CRF03_ABKal153все сиквенсы были объединены в один алаймент относительно Kal153и выравнены по длине. Длина алаймента составила 1437 нуклеотидов, из которых 1258 (87,5%) являлись идентичными сайту референса. Попарная идентичность (pairwise identity) между сиквенсами составила 96,4% (рисунок 4.5).

Определение направлений заноса и распространения CRF03_AB на территории Беларуси

Для определения направления заносов и распространения вируса на территории Беларуси путем поиска наиболее оптимального числа референсов для филогенетического анализа по результатам поиска методом BLAST были получены 25 референсных последовательностей ВИЧ-1 по участку гена pol. Длина алаймента вместе с исследуемыми образцами составила 1029 п.н., в референс-изоляте DQ328559 из Азербайджана 17 недостающих нуклеотидов 3’-конца были заменены на «N» с целью сохранения генетической информации в алайменте. Результаты филогенетического анализа рекомбинантной формы CRF03_AB представлены на рисунке 4.6.

На филогенетическом дереве не было выявлено ни одного достоверного кластера, сформированного как исследуемыми образцами, так и референсными последовательностями ВИЧ, со значением SH-aLRT³0,9. Два кластера со значением SH-aLRT 0,996 и 1 были сформированы исследуемыми образцами из Беларуси - Gr_3/Gr_8 и MnObl_15/Mg_8 соответственно. Это достоверно указывает на одного общего предка для каждой пары в кластере и на внутреннее распространении CRF03_AB на территории Беларуси. Отсутствие связей остальных исследуемых образцов между собой говорит об их независимом проникновении на территорию страны. Таким образом, рекомбинантная форма CRF03_AB была занесена в результате пяти независимых событий, два из которых привели к передаче вируса уже на территории Беларуси.

Достоверно установить пути заноса циркулирующей рекомбинантной формы CRF03_ABна территорию Беларуси не удалось. Вероятно, это связано с лимитом референс-сиквенсов CRF03_ABв Genbankи HIVSequenceDatabase по участку гена pol. Проведенный анализ сиквенсов в HIVsequencedatabase показал, что общее количество референсных сиквенсов CRF03_AB составило 366, однако большинство данных сиквенсов относилось к фрагментам генов ВИЧ-1 gag (100) и env(172)(рисунок 4.7).

По гену gagпрактическивсе найденные референсы, обозначенные в базах данных как CRF02_AG, оказались из Литвы (75) и Беларуси (21), обладающие крайне низкой генетической разнородностью. Стоит также отметить, что в базах данных субтипы сиквенсов не всегда установлены верно. Так, при поиске референсных сиквенсов для филогенетического анализа исследуемых CRF03_ABбыли найдены сиквенсы, которые обозначили как субтип B. Однако в ходе определения структурыгеномов данных референсных сиквенсов установлено, что они являются CRF03_AB.

По фрагменту gp120 гена envдлина референсов максимально достигала 378 п.н., а алаймент из всех референсов для данного сегмента генома составил всего 225 п.н., что не достаточно для установления достоверных филогенетических связей между вирусами.