Материал: Молекулярно-генетическая характеристика рекомбинантных форм вируса иммунодефицита человека 1 типа, выявленных на территории Республики Беларусь

Молекулярно-генетическая характеристика рекомбинантных форм вируса иммунодефицита человека 1 типа, выявленных на территории Республики Беларусь

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«РЕСПУБЛИКАНСКИЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ»

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1 ТИПА, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ВВЕДЕНИЕ

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является одной из наиболее значимых угроз для глобального здоровья человечества. Согласно современной классификации выделяют 2 типа ВИЧ: ВИЧ-1 и ВИЧ-2, основной вклад в эпидемию вносит ВИЧ-1, распространение которого в мире носит характер пандемии[1, 2], и на конец2014 года в мире насчитывалось около 36,9 миллиона человек, живущих с ВИЧ-инфекцией [3]. По данным ООН, 30-40 миллионов человек умерло от синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) с момента первого упоминания о ВИЧ-инфекции в начале 80-х годов XX века [4].

Одним из основных препятствий в борьбе с эпидемией ВИЧ/СПИД в мире является высокая скорость геномных мутаций и, как следствие, высокое генетическое разнообразие вируса. Результат такой высокой изменчивости - ускользание вируса от воздействий иммунной системы, возникновение мутаций резистентности и последующая невосприимчивость к терапии. Фундаментом генетического разнообразия ВИЧ-1 являются, по крайней мере, 3 фактора: многократное внедрение вируса в человеческую популяцию, низкая точность и высокая рекомбиногенность обратной транскриптазы ВИЧ-1, а также высокий уровень генетической гетерогенности вируса в инфицированном организме, называемый «квазивид».

При коинфекции человека двумя и более различными субтипами ВИЧ в процессе репликации вируса могут возникать рекомбинантные формы. Такие вирусы содержат генетический материал от разных родительских вариантов ВИЧ. Это создает дополнительную проблему при разработке вакцин, поскольку, согласно рекомендациям ООН, кандидатные вакцины должны создаваться на основе штаммов вирусов, доминирующих в конкретном регионе. Кроме этого, рекомбинантные формы могут наследовать мутации резистентности от родительских вариантов, тем самым снижая эффективность высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ).

В Республике Беларусь за последние 5 лет ежегодно регистрируется более 1000 новых случаев ВИЧ-инфицирования, а за 2015 год количество выявляемых случаев превысило 2000. Хотя доминирующим субтипом ВИЧ-1 в Беларуси является субтип A1, зарегистрировано появление циркулирующих рекомбинантных форм (ЦРФ) ВИЧ-1, а также впервые выявлена новая уникальная рекомбинантная форма (УРФ) ВИЧ-1 AB, ранее никем не описанная.

Все это создает предпосылку для выявления и молекулярно-генетического анализа рекомбинантных форм ВИЧ-1 на территории Республики Беларусь.

Связь работы с крупными научными программами и темами

Тема диссертационного исследования и научный руководитель были утверждены приказом директора РНПЦ эпидемиологии и микробиологии от 29.12.2012№ 56.

Исследования были выполнены в государственном учреждении «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» по заданию 02.16 «Разработать диагностическую тест-систему для определения мутаций резистентности ВИЧ-1» (2013-2015гг., № госрегистрации 20115329 от 16.12.2011); по заданию 01.08 «Разработать и внедрить в практику здравоохранения систему молекулярно-эпидемиологического мониторинга за ВИЧ/СПИД, подготовить и внедрить контрольную панель сывороток крови на основе преобладающих в Беларуси субтипов ВИЧ-1» (2011-2013 гг., № госрегистрации 20115334 от 16.12.2011) в рамках выполнения ГНТП «Новые технологии диагностики, лечения и профилактики», подпрограмма «Инфекции и микробиологические нанотехнологии»; по заданию 4.14 «Разработать тест-систему ПЦР на основе консенсусных последовательностей гена pol для диагностики и генотипирования ВИЧ-1» в рамках выполнения Подпрограммы 1 «Инновационные биотехнологии в Республике Беларусь», МЦП ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» на 2014-2015 гг.

Цель и задачи исследования

Цель исследования: дать молекулярно-генетическую характеристику рекомбинантных форм ВИЧ-1, выявленных на территории Республики Беларусь.

Задачи исследования:

. Провести молекулярно-генетический скрининг ВИЧ-1, выявленного на территории Беларуси за период 2008-2015 годов.

. Определить спектр и распространенность рекомбинантных форм ВИЧ-1 в популяции ВИЧ-инфицированных пациентов, проживающих на территории Республики Беларусь.

. Установить филогенетические связи выявленных рекомбинантных форм ВИЧ-1, определить направления заноса вирусов на территорию страны, выявить мутации резистентности к антиретровирусным препаратам.

. Изучить структуру полноразмерного генома новой уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 и установить ее происхождение.

Научная новизна

1. Установлено, что на территории Республики Беларусь за период 2008-2015 гг. доминировал ВИЧ-1 субтипа А1, на который приходилось 90,7%. Кроме субтипа А1 выявлено 15 случаев ВИЧ-инфекции (4,9%), вызванных рекомбинантными формами ВИЧ-1, 9 случаев (3,0%) - субтипом В, и по 2 случая (0,7% каждый) - субтипами C и G.

. Впервые на территории Республики Беларусь в популяции ВИЧ-инфицированных пациентов определен спектр рекомбинантных форм ВИЧ-1, выявлено три типа циркулирующих рекомбинантных форм ВИЧ-1: CRF03_AB - 8 (2,6%), CRF02_AG - 4 (1,3%), CRF06_cpx - 2 (0,7%), и одна уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 (0,3%).

. Установлены многократные случаи заноса циркулирующих рекомбинантных форм ВИЧ-1 на территорию Беларуси: CRF03_AB - занесена в результате шести независимых событий, два из которых привели к дальнейшему распространению CRF03_AB уже на территории страны, CRF02_AG - занесена в результате трех событий, в двух случаях происхождением вируса является территория Западной Африки и в одном случае две CRF02_AG (ВИЧ-инфицированные мать и ее ребенок) происходят из Узбекистана, две CRF06_cpx были занесены в результате одного события - родственны ВИЧ-1, описанному на территории Эстонии.

. Впервые секвенирован и описан полноразмерный геном уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 Mos. Установлено, что ее геном имеет мозаичную структуру и состоит из ВИЧ-1 субтипов А1 (~80%) и В (~20%), встраивание субтипа В произошло в структурных генах gag и pol. Метод кластерного филогенетического анализа показал, что фрагменты субтипов А1 и В относятся к вариантам ВИЧ-1 AFSU и BFSU, получившим распространение на территории стран бывшего СССР.

Положения, выносимые на защиту

1. На территории Республики Беларусь за период 2008-2015 гг. доминировал ВИЧ-1 субтипа А1, на который приходилось 90,7% (207 из 303) проанализированных сиквенсов ДНК по участку гена pol. Рекомбинантные формы ВИЧ-1 по частоте встречаемости находись на втором месте - 4,9% (15) от всех проанализированных последовательностей ДНК: CRF03_AB - 8 (2,6%), CRF02_AG - 4 (1,3%), CRF06_cpx - 2 (0,7%), и в одном случае (0,3%) выявлена уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 между субтипами A1 и B. Выявлено 9 случаев (3,0%) ВИЧ-инфекции, вызванной субтипом В, и по 2 случая (0,7% каждый), вызванных субтипами С и G ВИЧ-1 соответственно.

. Рекомбинантные формы ВИЧ-1 занесены на территорию Республики Беларусь в результате множественных событий. Наиболее часто встречаемая рекомбинантная форма CRF03_AB занесена в результате шести независимых событий, вероятнее всего, с территорий России и Литвы. Два события привели к дальнейшему распространению CRF03_AB уже на территории страны. Рекомбинантная форма CRF02_AG занесена на территорию страны из трех независимых источников: в двух случаях вирус происходит с территории Западной Африки, в одном случае две CRF02_AG (ВИЧ-инфицированные мать и ее ребенок) - с территории Узбекистана. Две CRF06_cpx занесены на территорию Беларуси в результате одного события, вероятнее всего, из Эстонии.

. Новая уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 Mos является результатом рекомбинации ВИЧ-1 субтипов А1 и В, встраивание фрагментов генома субтипа В произошло в структурных генах ВИЧ-1 gag и pol. На долю ВИЧ-1 субтипа А1 приходится порядка 80% генома УРФ ВИЧ-1 Mos, на субтип B - 20%. Геном ВИЧ-1 Mos состоит из фрагментов геномов ВИЧ-1 AFSU/BFSU, получивших распространение на территории стран бывшего СССР, и не является рекомбинантной формой CRF03_AB.

Личный вклад соискателя ученой степени

Научным руководителем предложены тема диссертационной работы и ее методическое решение. Соискатель самостоятельно определил цель и задачи исследования, выбор методов и объем исследований. Автор лично выполнил первичную обработку исследуемого материала (сыворотки и плазмы крови), полученного от ВИЧ-инфицированных пациентов, получил сиквенсы участка генов gag-pol исследуемых образцов, создал электронную базу данных для внутрилабораторного хранения и учета информации о пациентах. Диссертант полностью провел филогенетический анализ и молекулярно-генетические исследования рекомбинантных форм ВИЧ-1, выявленных на территории Республики Беларусь, установил их структуры геномов, профили резистентности, а также происхождение и распространение на территории страны. Автором пополнена международная база данных Genbank 241 нуклеотидной последовательностью ВИЧ-1 областей генов gag-pol и 1 полноразмерным геномом ВИЧ-1 субтипа А1. На основании проведенных исследований получен патент на новую уникальную рекомбинантную форму ВИЧ-1 Mos № 18124 [31-A] (вклад соискателя - 30%).

Основные научные результаты представлены в статьях с долей личного участия соискателя соответственно: [1-A, 2-A] - 50%, [3-A] - 30%, [4-A] - 70%, [5-A] - 50%, [6-A, 7-A] - 10%, [8-A] - 70%, [9-A, 10-A] - 10%, [11-A] - 30%, [12-A] - 80% (в среднем 39%); в материалах научных форумов и тезисах докладов [13-A, 14-A] - 30%, [15-A] - 30%, [16-A, 17-A] - 20%, [18-A] - 70%, [19-A] - 30%, [20-A-22-A] - 10%, [23-A] - 70% (в среднем 30%); в сборниках рецензируемых научных трудов [24-A-28-A] - 20% (в среднем 20%). На основании проведенных исследований утверждены 2 инструкции по применению: по генотипированию и определению мутаций резистентности в геноме ВИЧ-1 [29-A, 30-A] (вклад соискателя 30%).

Апробация диссертации и информация об использовании ее результатов

Основные положения работы были доложены и обсуждены на конференции «Основы инфекционной патологии человека» (30-31 октября 2014 г., г. Минск, Беларусь); на 12 ежегодной конференции Балтийской Антивирусной Сети «Вирусные инфекции регионального значения» (3-5 октября 2015 г., г. Москва, Россия); мини-симпозиуме «Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 и вирусных гепатитов в Балтийском регионе» (19-21 марта 2015 г., Каролинский Институт, г. Стокгольм, Швеция). Результаты проведенных исследованийбыли использованы при созданииотечественной диагностической тест-системы для определения мутаций резистентности и генотипирования ВИЧ-1 «Бел ВИЧ-1 резистентность-генотип» - регистрационное удостоверение № ИМ-7.103886, для создания контрольной панели «Панель контрольная сывороток крови, содержащих и не содержащих антитела к специфическим белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и антигены ВИЧ-1» - регистрационное удостоверение № ИМ-7.102188.

Опубликование результатов диссертации

Результаты диссертационной работы опубликованы в 31 научной работе, из них 12 - статьи в журналах, включенных в перечень научных изданий ВАК (объем 5,9 авторских листа), 11 - в материалах научно-практических конференций (объем 3,3 авторских листа), 5 - в сборниках рецензируемых научных трудов (1,1 авторских листа), 2 - в инструктивно-методических рекомендациях, 1 - патент. Общий объем публикаций составляет 10,3 авторских листа.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследований, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, библиографического списка (190англоязычных и 7 русскоязычных источников), списка работ соискателя, 5 приложений. Работа изложена на 137 страницах, содержит 18 таблиц и 38 рисунков.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

.1 История открытия ВИЧ

В конце 80-х - начале 81-х гг. прошлого века в США среди мужчин, практикующих секс с мужчинами (МСМ), и потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) без известных на то время причин были выявлены случаи пневмоцистной пневмонии [5, 6]. Практически в это же время появились сообщения об обнаружении у еще одних МСМ редкой формы онкологического заболевания кожи - саркомы Капоши [7, 8]. Оба эти заболевания представляют собой редкие оппортунистические инфекции, проявляющиеся у лиц с серьезными нарушениями иммунной системы. Вскоре после первых сообщений о вспышке данных заболеваний в США стали появляться сообщения о схожих симптомах и в других частях света. Состояние, при котором возникали эти инфекции, назвали синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), однако причина СПИДа стала известна лишь в 1983г., когда независимо друг от друга в Институте Пастера во Франции под руководством Люка Монтанье и в Национальном институте рака в США под руководством Роберта Галло был изолирован новый ретровирус, названный вначале вирусом, ассоциированным с лимфаденопатией (lymphadenopathy-associated virus, or LAV) [9] и Т-лимфотропным вирусом человека [10]. В 1986 году обнаружили, что эти два вируса генетически идентичны, и им было присвоено наименование «вирус иммунодефицита человека» (ВИЧ) [11]. В 2008-м Люк Монтанье и Франсуаза Барр-Синусси были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины «за открытие вируса иммунодефицита человека» [12].

1.2 Организация генома и кодируемые белки ВИЧ

Генетический материал ВИЧпредставлен двумя копиями положительно-смысловой (+)РНК. Длина молекулы РНК составляет в среднем около 9700 нуклеотидов и содержит 3 рамки считывания(рисунок 1.1)[13].

Как и у всех вирусов Семейства Retroviridae, геном ВИЧсодержит 3 основных структурных гена gag, pol и env, кодирующих структурные белки вируса и ферменты, необходимые для вирусной репликации. Помимо структурных, геном ВИЧ-1 включает гены tat, rev, nef, vif, vpr и vpu (vpx у ВИЧ-2)[14],кодирующие белки, которые участвуют в регуляции экспрессии других вирусных генов и поддержании латентной стадии вируса(таблица 1.1)[15].

Таблица 1.1. - Продукты генов ВИЧ-1и их основные функции