Материал: Молекулярно-генетическая характеристика рекомбинантных форм вируса иммунодефицита человека 1 типа, выявленных на территории Республики Беларусь

В 2010 г. в лабораторию диагностики ВИЧи сопутствующих инфекций из дома ребенка от девочки 6 лет, находящейся на ВААРТ, поступил образец крови для определения мутаций резистентности ВИЧ-1 к АРП.

При определении субтипа ВИЧ-1 методом филогенетического анализа сегмента гена pol образец кластрировался с субтипом А1, но отличался от других анализируемых образцов консенсуса IDU-A(AFSU) и референс-последовательности (AF004885). Среднее значение p-дистанций между референсными сиквенсами субтипа А1 из России, Украины, консенсусом IDU-Aи изолятом Mosсоставило 0,068, в то время как между референсными сиквенсами субтипа В - 0,094. По сегменту гена polизолят Mosбыл наиболее близок к референсу AF413987 (субтип А1 из Украины), p-дистанция составила 0,066(рисунок 5.1, А).

Анализ участка p17/p24гена gag показал, что средниеp-дистанции по данному участку с референсами субтипа А1 составили 0,129, в то время как с референсами субтипа В - 0,075(рисунок 5.1, Б).Эволюционная дистанция по сегменту гена env между ВИЧ-1 Mos и референс-последовательностями CRF03_AB (AF414006, Беларусь и AF193276.1, Россия, Калининград) составила 0,121, в то время как между самими референс-последовательностями - 0,013. По этому же сегменту средние p-дистанции между ВИЧ-1 Mos и референс-последовательностями ВИЧ-1 субтипов А1 и В составили 0,155 и 0,323 соответственно(рисунок 5.1, В).

Таким образом, изолят Mosбыл отнесен к уникальной рекомбинантной форме ВИЧ-1 со структурой BgagApolAenv. Сиквенсы сегментов генов gag, pol и env данной рекомбинантной формы были загружены в EMBL/Genbank/DDBJ под номерами FR775442.1, FN995656.1 и FR775443.1 соответственно.

Структура полноразмерного геномаУРФMos

Для установления точной структуры уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 Mos и выявления точек разрыва генома была получена последовательность нуклеотидов полноразмерного генома данного изолята. Амплифицированныйфрагмент, равный 8968 п.н., охватывает последовательности, кодирующие все белки ВИЧ-1 и частично LTR. Координаты относительно референс-типа ВИЧ-1 HXB2 соответствовали последовательностям 556-9517.

С использованием программы jpHMMустановлены структура генома и координаты рекомбинационных событий изолята Mos.Геном уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 Mos представляет собой ВИЧ-1 субтипа А1 со встроенными в четырех местах сегментами генома ВИЧ-1 субтипа В, встраивание фрагментов ВИЧ-1 субтипаВ произошло в структурных генах gag и pol(рисунок 5.2).

Доминирующим в структуре генома Mosявляется ВИЧ-1 субтипа А1, занимающий порядка 80% генома - 7214 п.н. На долю ВИЧ-1 субтипа В приходится около 20% - 1965 п.н.

Сравнительный анализ генома Mosс уже известной рекомбинантной формой CRF03_ABпоказал, что Mosне является результатом рекомбинации с CRF03_AB, и в геноме Mosотсутствуют фрагменты данной ЦРФ. Об этом свидетельствуют различные структуры геномов рекомбинантных форм и не совпадение ни одной из точек разрыва генома, показанные на рисунке 5.3.Так, у рекомбинантной формы CRF03_AB первая точка рекомбинациинаходится в координате 2688 относительно HXB2, в то время как у УРФMosв данном участке генома находится сегмент субтипа А1, координаты которого 2449±7 ⟷ 2990±41, что исключает совпадение рекомбинационных точек в этом участке генома. Вторая координата рекомбинации у CRF03_AB - переход генома ВИЧ-1 субтипа Bв субтип А1 - находится в точке с координатой 8650. В геноме УРФ Mosсегмент субтипа A1на 3’-конце начинается в координатах 4819±70. Таким образом, геном УРФ Mos является результатом рекомбинации геномов ВИЧ-1 «чистых» субтипов A1и B и не содержит фрагмента генома CRF03_AB.

Происхождение УРФ Mos

С целью определения происхождения уникальной рекомбинантной формы, ее геном был разделен на 9 сегментов, относящихся к различным субтипам ВИЧ-1 (рисунок 5.4), согласно координатам точек разрыва генома(таблица 5.1).

Таблица 5.1. - Координаты сегментов изолята Mos, их размер и соответствующий субтип ВИЧ-1. Координаты указаны относительно референсного сиквенса HXB2

Первым этапом наших исследований являлось определение участков генома Mos, наиболее подходящих для поиска референсов и проведения филогенетического анализа. С этой целью был применен поиск с помощью программы BLAST для выявления географического распределения генетически близких изолятов. Как показали результаты поиска, все найденные референсы ВИЧ-1 с совпадением нуклеотидов не менее 98% относились к странам бывшего СССР. Следующим шагом стало определение участков, наиболее подходящих для филогенетического анализа. Критерием отбора являлось наличие наибольшего количества референсов для конкретного исследуемого сегмента. С этой целью были загружены все имеющиеся в базе данных Genbank референс-последовательности ВИЧ-1 субтипов А1 (4476 сиквенсов) и В (479 сиквенсов), с которыми построено два алаймента относительно УРФ Mos. Визуализация алаймента помогла определить, какие сегменты изолята Mosнаиболее целесообразно использовать для филогенетического анализа(рисунок 5.5).

Изрисунка 5.5 видно, что наибольшее количество референсов ВИЧ-1 обоих субтипов, А1и B, имеется для фрагмента гена pol, кодирующего протеазу и часть обратной транскриптазы ВИЧ. Это соответствует сегментам А5, небольшой части сегмента А9,B4 и B6 генома Mos. Ввиду того, что для анализа сегментов субтипа Вреференсов оказалось почти в 10 раз меньше, чем для субтипа А1 (286 и 2530 соответственно), для анализа был взятсегментB8 субтипа B - от начала участка, кодирующего интегразу ВИЧ-1 (таблица 5.2). Сегмент B6 был исключен из анализа, поскольку референсы для филогенетического анализа, найденные с помощью BLAST, оказались идентичными, как для сегмента B4.

Таблица 5.2. - Сегменты изолята Mos, их длина, координаты относительнореференс-типа ВИЧ-1 HXB2 и субтип ВИЧ, к которому сегмент относится, взятые для филогенетического анализа

Для построения филогенетических деревьев с исследуемыми сегментами с помощью BLASTбыл произведен повторный поиск 20наиболее генетически близких референс-последовательностей ВИЧ-1 для сегментов А5, А9, В2, В4 и В8. Готовые алайменты с субтип-референсами ВИЧ-1, включая рекомбинантные формы, получены из базы данных LosAlamosHIVSequenceDatabase. Все сиквенсы были выравнены и отредактированы вручную. Референс-сиквенсы группы Pудалены из алайментов.Референс-субтипы ВИЧ, а также некоторые кластеры сгруппированы для более наглядного изображения филогенетического дерева.

Филогенетический анализ сегментов генома субтипа A1

Алаймент сиквенсов ВИЧ-1 для филогенетического анализа сегмента А1 изолята Mosсодержал 171 сиквенс, длина которого составила 548 п.н. На основании алаймента было построено ML-филогенетическое дерево, показанное на рисунке 5.6.

Как видно из данных, представленных на филогенетическом дереве на рисунке 5.7,референсные сиквенсы, полученные встранах бывшего СССР, сформировали кластер, значение SH-aLRT которого составило 0,986. Исследуемый фрагмент Mos_A5 располагался внутри данного кластера, однако не формировал субкластер ни с одним из референсов.

Все референсные сиквенсы, найденные с помощью программы BLAST, сформировали большой кластер с высоким уровнем генетической гомогенности, значение SH-aLRTкластера составило 0,996. Исследуемый фрагмент изолята Mosнаходился внутри данного кластера, однако субкластер одним из референсных сиквенсов выявлен не был. Высокое значение SH-aLRT кластера с референсными сиквенсами, в основном из стран бывшего СССР, свидетельствует о том, что данные сиквенсы являются вариантами ВИЧ-1 AFSU, к которому относится и исследуемый сегмент генома изолята Mos.

Таким образом, по результатам филогенетического анализа двухсегментов генома, относящихся к субтипу А1 ВИЧ-1, не было найдено генетически близких референсных сиквенсов ВИЧ, с которыми изолят Mosсформировал кластер со значением SH-aLRT ≥0,85. На основании результатов анализа невозможно сказать, принадлежат ли фрагменты генома, относящиеся к субтипу А1, к штаммам, циркулирующим на территории Республики Беларусь. Достоверно можно утверждать, что сегменты субтипа А1 в геноме УРФ Mosпринадлежат варианту ВИЧ-1 AFSU, распространенному на территории стран бывшего СССР.

Филогенетический анализ сегментов генома субтипа B

По результатам филогенетического анализа сегмента B2 генома Mosустановлена достоверная генетическая близость с референсными сиквенсами из Грузии (98GEMZ003), России (11RU21n)и США (E6574TOB8U), которые сформировали кластер со значением SH-aLRT - 0,999(рисунок 5.8).

Анализ сегмента B4 выявил генетическую близость с референсными сиквенсами из Грузии, России, Беларуси и группы референсов из Таиланда (сгруппированы на филогенетическом дереве) и формировал с ними кластер (выделен синим), значение SH-aLRT которого составило 0,942(рисунок 5.9).

В ходе филогенетического анализа установлено, что сегментB8изолята Mosсформировал кластер с референсными сиквенсами, представляющими рекомбинантную формуCRF03_ABиз Калининграда (KAL153_2), России (RU9800), Беларуси (98BY10443), а также с сиквенсами «чистого» субтипа B из США (E6574TOB8U) и Грузии (98GEMZ003)(рисунок 5.10). Значение SH-aLRTкластера с образцом Mosсоставило 0,979.

По результатам филогенетического анализа сегментов субтипа B изолята Mosнайдены генетически близкие сиквенсы изГрузии98GEMZ003 и России11RU21n.С референсом из США E6574TOB8U исследуемые сегменты кластрировались при анализе сегментов B2 и B8, а при анализе сегмента B4 выявлены также генетически близкие референсы из Беларуси и Таиланда.

Какие-либо эпидемиологические данные по референсам из США (E6574TOB8U, Genbank: GQ371853, GU728194) и России (11RU21n, Genbank: JX500708) в базе данных Genbankотсутствуют. Про референс 98GEMZ003 в Genbank (DQ207943) указано, что данный пациент, вероятно, инфицирован на Украине на раннем этапе эпидемии ВИЧ-1 в бывшем СССР (год сбора образца - 1998).

Стоит обратить внимание на размеры генетически близких референсных сиквенсов ВИЧ, найденных методом филогенетического анализа. Так, сиквенсы 98GEMZ003, E6574TOB8U и 11RU21n представляют собой полноразмерные геномы ВИЧ-1 субтипа B, сиквенсы KAL153_2 и 98BY10443 являются полноразмерными сиквенсами ЦРФ CRF03_AB, а сиквенс Mn_9 и группа сиквенсов из Таиланда содержат только последовательно относящиеся лишь к фрагменту гена pol, кодирующего протеазу и часть обратной транскриптазы ВИЧ.С референсными сиквенсами98GEMZ003 и 11RU21n участки генома Mosобразуют кластеры при филогенетическом анализе всех трех исследуемых фрагментов субтипа B, в то время как с референсом E6574TOB8U кластеры были образованы только по сегментам B2 и B8, кодирующимp17/p24 гена gagи интегразу гена pol соответственно. При этом не было обнаружено генетической близости с E6574TOB8U в участке гена pol, кодирующего протеазу ВИЧ.

Таким образом, по результатам филогенетического анализа сегментов, относящихся к субтипу BВИЧ, выявлено только два референсных сиквенса, имеющих генетическую близость c Mosна протяжении всего исследуемого генома -98GEMZ003 и 11RU21n. Однако принимая во внимание, что два этих сиквенса были получены от пациентов, проживающих в разных регионах, невозможно точно установить географическое происхождение УРФ Mosпо субтипу В. Можно лишь достоверно утверждать, что фрагменты субтипа Bгенома Mosпринадлежат варианту ВИЧ-1 субтипа B, получившего распространение на территории бывшего СССР - BFSU.

По результатам филогенетического анализа сегментов генома изолята Mos, относящихся к различным субтипам ВИЧ, достоверно можно лишь утверждать, что геном изолята состоит из субтипов ВИЧ-1 А1 и В, вызвавших эпидемию ВИЧ-1 на территории стран бывшего СССР (таблица 5.3). Установить,в каких географических регионах распространены эти изоляты ВИЧ-1,не удалось.

Таблица 5.3. - Сумма результатов филогенетического анализа сегментов генома УРФ Mos, относящихся к разным субтипам ВИЧ

Таким образом, на основании проведенных исследований в данной главе можно сделать следующие выводы:

уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 Mos является результатом рекомбинации ВИЧ-1 субтипов А1 и В;

встраивание фрагментов генома субтипа В произошло в структурных генах ВИЧ-1 gag и pol;

в геноме Mos не выявлено фрагментов рекомбинантной формы CRF03_AB;

на долю ВИЧ-1 субтипа А1 приходится порядка 80% генома УРФ Mos, на субтип B - 20%;

методом филогенетического анализа определено, что геном Mos состоит из фрагментов геномов ВИЧ, получивших распространение на территории стран бывшего СССР. Более точную географическую локализацию на данный момент времени установить не удалось.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные научные результаты диссертации

1. На протяжении 2008-2015 гг. субтип А1 оставался доминирующим в эпидемии ВИЧ-инфекции на территории Республики Беларусь во всех группах населения: потребителей инъекционных наркотиков; лиц, инфицированных половым путем; а также у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями. На долю данного субтипа пришлось 90,7% (275 из 303) проанализированных случаев ВИЧ-инфекции. При филогенетическом анализе все образцы субтипа А1 формировали кластер с высоким уровнем генетической однородности, значение SH-aLRT данного кластера составило 1, что свидетельствует о том, что все образцы ВИЧ-1 данного субтипа, циркулировавшие на территории Беларуси в популяции ВИЧ-инфицированных пациентов, являлись вариантом AFSU, вызвавшим эпидемию ВИЧ-инфекции на территории других стран бывшего СССР. Кроме субтипа А1, на территории Беларуси были выявлены ВИЧ-1 субтипов B, C, G, ЦРФ CRF02_AG, CRF03_AB, CRF06_cpx, УРФ ВИЧ-1, названная Mos [2-А, 3-А, 4-А, 5-А, 6-А, 7-А, 9-А, 10-А, 12-А, 13-А, 15-А, 16-А, 17-А, 22-А, 23-А, 27-А].